Імуноферментний метод аналізу.
Імуноферментний аналіз (ІФА) – діагностичний імунологічний метод, за допомогою якого можна визначити якісний і кількісний склад антигенів і антитіл. В даний час метод ІФА застосовується в різних галузях медицини, однак найбільш часто за допомогою даного методу діагностуються інфекційні захворювання, такі як ВІЛ-інфекція, туберкульоз, гепатит, інфекції, що передаються статевим шляхом та інші. Крім того, за допомогою ІФА визначається алергологічний і гормональний статус пацієнта.
При встановленні діагнозу захворювання метод ІФА дає 90% точність.
При попаданні в організм людини чужорідного агента (антигену) система імунітету починає виробляти специфічні білки (антитіла), які необхідні для знищення антигенів. Антитіла вибірково зв’язуються з антигенами, утворюючи комплекси антиген-антитіл. В ході імуноферментного аналізу саме даний комплекс і піддається якісному і кількісному аналізу. Приміром, якщо необхідно виявити певний вірус (а точніше його антиген) в крові, в неї додають специфічні до вірусу антитіла. Навпаки, для виявлення антитіл в зразки крові додаються специфічні антигени.
В даний час використовується величезна кількість всіляких різновидів і модифікацій ІФА. Широке поширення одержали різні варіанти твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA).
Твердофазний ІФА був запропонований в 1971 році. Основні принципи твердофазного ІФА, незалежно від модифікації, полягають у наступному:
1. На 1 етапі реакції адсорбують антигени або антитіла на твердій фазі. При цьому не пов'язані з твердою фазою реагенти легко видаляються відмиванням.
2. У сенсибілізованих лунках інкубують досліджуваний зразок. В лунках з позитивним контролем – стандартні реагенти. При цьому на поверхні твердої фази формуються імунні комплекси. Незвязані компоненти видаляють відмиванням.
3. При додаванні кон'югату антитіло-фермент або антиген-фермент і зв'язування його з іммобілізованим імунним комплексом активний центр ферменту залишається доступним для подальшого взаємодії з субстратом. Інкубація субстрату в лунках з іммобілізованим кон'югатом призводить до розвитку кольорової реакції. Цю реакцію можна зупинити на потрібній стадії, вираженість фарбування можна оцінити візуально або по оптичній щільності.
|
|
|
Важливий етап будь-якого варіанту твердофазного аналізу – процедура відмивання від незвязуваних реагентів. Важливо не просто сполоснути фіксовані на твердій фазі компоненти, а видалити реагенти з усієї глибини шару. Це найбільш тривалі і трудомісткі етапи аналізу. Промивання проб може проводитися в автоматичному режимі з допомогою спеціального приладу – вошера або вручну, багатоканальної піпеткою. Для проведення ІФА необхідні:
|
|
|
– полістироловий планшет або використовуються інші варіанти твердої фази;
– відмиваючий розчин;
– кон'югат (мічені ферментною міткою антигени або антитіла);
– суміш використовуваних субстратів;
– зупиняє розчин (Стоп-реагент – розчин для останавливания реакції);
– зразки, що використовуються для позитивного та/або негативного контролю;
– стандартний антиген (для побудови калібрувальної кривої);
– одно - та багатоканальні піпетки;
– вошер (промивач);
– оптичний прилад для визначення оптичної щільності досліджуваного розчину (ІФА-рідер, зчитувач, який послідовно фотометрує всі лунки);
– 5-100 мкл досліджуваного біологічного матеріалу.
Матеріалом для проведення імуноферментного аналізу є кров, взята з вени.Крім крові для ІФА можуть знадобитися навколоплідні води і матеріал склоподібного тіла.Імуноферментний аналіз крові дозволяє виявити антитіла різних видів. Це імуноглобуліни класу А, М, G. Накопичення даних антитіл відбувається в різні проміжки часу. Наприклад, першими після початку захворювання (на п’ятий день) починають накопичуватися імуноглобуліни класу М. Ці імуноглобуліни циркулюють в організмі приблизно 5-6 тижнів, після чого поступово зникають. У цей часовий проміжок і виявляються імуноглобуліни даного класу.Приблизно через 3-4 тижні після захворювання з’являються імуноглобуліни G, які можуть затримуватися в організмі людини протягом декількох місяців. Однак цього може і не відзначатися. При проведенні імуноферментного аналізу може відзначатися зростання імуноглобулінів G, що свідчить про наявність інфекційного процесу або реінфекції.Імуноглобуліни А виявляються в крові протягом 2-4 тижнів, проте всього 20% з них знаходяться в сироватці крові, інші 80% містяться в секреті слизових оболонок. Як правило, антитіла класу А зникають в період часу від 2 тижнів до 2 місяців. Така динаміка свідчить про знищення інфекційного процесу. Якщо ж після одужання результат імуноферментного аналізу все одно показує наявність імуноглобулінів А, то це свідчення хронізації інфекційного процесу.
|
|
|
Імуноферментний аналіз застосовується в наступних діагностичних цілях:
o для діагностики вірусних інфекцій: туберкульоз, герпес, ВІЛ-інфекція, гепатити, вірус Епштейна-Барра, цитомегаловірус та інші;
o інфекції, що передаються статевим шляхом: гонорея, хламідіоз, мікоплазма, трихомонада, уреаплазма;
|
|
|
o сифіліс;
o діагностика онкологічних захворювань (онкомаркери);
o діагностика імунодефіцитних станів;
o діагностика алергії.
Всі показники, отримані при проведенні імуноферментного аналізу повинні розшифровуватися і інтерпретуватися кваліфікованим лікарем.
ІФА знайшов широке застосування в різних областях медицини і біології завдяки відносній простоті і високій чутливості методу. ІФА успішно застосовується для:
• масової діагностики інфекційних захворювань (виявлення різних специфічних антигенів або антитіл до них);
• виявлення і визначення рівня гормонів і лікарських препаратів у біологічних зразках;
• визначення изотипов (IgG, IgM та інші) антитіл проти конкретного антигену;
• виявлення імунних комплексів;
• виявлення онкомаркерів;
• визначення білків сироватки крові (феритин, фібронектин та ін);
• визначення загального IgE і специфічних IgE антитіл;
• скринінгу моноклональних антитіл;
• визначення цитокінів у біологічних рідинах.
ІФА прийшов на зміну широко використовуваним раніше в клінічній практиці методів аглютинації, преципітації і РІА. Порівняно з вищеназваними методами ІФА менш трудомісткий і менш тривалий за часом, зручний для виконання великого числа однотипних аналізів.
В ІФА поєднується унікальна специфічність імунохімічного аналізу з високою чутливістю визначення ферментної мітки. Чутливість методу (під чутливістю розуміють мінімальне виявляється кількість антитіл або антигену) визначається наступними факторами: краще використання моноклональних антитіл; специфічною активністю ферменту; інтенсивністю сигналу; чутливістю обліку сигналу. Різні варіанти ІФА розрізняються по своїй чутливості. Окремі варіанти твердофазного ІФА дозволяють виявляти в зразку поодинокі молекули. Середня чутливість ІФА – 10-9 – 10-12 моль.
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 516; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!