РОЗДІЛ 5. Обґрунтування вибору технологічної схеми біосинтезу субстанції
Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування
Для одержання рекомбінантного туберкулопротеїну використовують мікроорганізми з наступними показниками:
1. Видова назва культури - Escherichia coli TUB A60
2. Спосіб одержання штаму - генно-інженерний
3. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму - типовий
4. Патогенність ( непатогенність, довідка додається або група патогенності за списком СЕС): умовно-патогенний
5. Генетичні особливості штаму (ауксотрофність, резистентність до антибіотиків, тощо) - резистентний до ампіциліну – 200 мкг/мл
Галузь використання штаму: біотехнологія, медицина
6. Спосіб, умови та склад середовища:
· для довготривалого зберігання (до 5 років)
-середовище LB з 15% гліцерину при –70 °С;
- банк рекомбінантних плазмід у замороженому стані при - 30 °С
· для короткотривалого зберігання ( до 1 року) – агаризованеживильне середовище LB ( 0,75% агару "Difco") при + 4°С;
для виробничого культивування – середовище Н15.
На підприємстві створюється музей рекомбінантних штамів мікроорганізмів. Культури зберігаються в замороженому стані, внаслідок чого, довгий час не втрачають життєздатності. У виробництві тест-систем використовуються рекомбінантні штами E. coli , які є найулюбленішим об’єктом більшості робіт з клонування у генетичної інженерії, оскільки цей організм найбільш детально вивчений на молекулярному рівні, генетично модифіковані таким чином, що клітини синтезують білок, який є аналогом поверхневого антигену мікобактерій туберкульозу. Це зроблено для того, щоб не потрібно було працювати з небезпечними видами мікроорганізмів.
|
|
|
Зберігання та відтворення музейних культур проводиться згідно розроблених методик, які були створені на базі експериментальних даних. Данні методики на сьогоднішній час є аксіомою мікробіологічної промисловості.
Мета проведення скринінгу клонів представляє собою підтримання продуктивності клонів, а також вибір клону для промислового культивування. Необхідність проведення скринінгу клонів обумовлена тим, що при зберіганні музейної культури проходить її диспропорціювання. Тобто хоча первісником цієї культури був один штам продуцента, його нащадки після тривалого зберігання володіють різними здібностями до накопичення цільового продукту. Необхідно відмітити, що клони, які несуть екзогенну ДНК мають більш метаболічне навантаження, ніж клони без неї, що призводить до витиснення клонів, які мають здатність синтезувати цільовий продукт. Критерієм селекції клонів є накопичення продуцентом цільового продукту. Вибраний клон буде використовуватись у майбутньому в якості готової посівної культури.
|
|
|
Використана культура застосовується для отримання первинної маточної культури яка у свою чергу використовується для одержання вторинної маточної культури. Вторинна маточна культура застосовується для інфікування поживного середовища при промисловому культивуванні. Сигналом для переходу до наступного етапу культивування є збільшення густини, для вторинної маточної культури вона становить ОГ450=0.7-0.8, а для широкомасштабного культивування ОГ600=0.95-1.00. Контроль оптичної густини дозволяє проводити культивування в логарифмічній фазі росту. Після широкомасштабного культивування проводять фазу термошока, при якій температуру збільшують до 40 0С. При цій температурі в клітці активується синтез цільового білка антигена. Утворення тілець включення аналізують за допомогою мікроскопу. Сигналом припинення культивування є припинення в збільшенні тілець включення.
Обґрунтування вибору способу культивування і типу ферментера
Проведення біосинтезу відноситься до найбільш важливої та відповідальної ділянки виробництва біотехнологічної продукції. Спосіб проведення біосинтезу необхідно проводити так, щоб максимально зменшити затрати та отримати максимальну кількість цільової продукції, враховуючи усі особливості біологічного агенту, його потреби для надсинтезу цільової продукції.
|
|
|
Проведення біосинтезу можна реалізовувати різними шляхами, як технічними так і технологічними. Особливості обраних способів впливатимуть на хід усього процесу. Технологічна схема, яка обирається повинна забезпечувати оптимізацію усіх виробничих заходів з точним дотриманням оптимальних умов на кожній стадії, необхідних для синтезу кінцевої продукції[].
Продуценти біологічно активних сполук можна культивувати двома способами: поверхневим, коли культуру вирощують в тонкому шарі сипучого або пористого середовища з аерацією; глибинним, коли продуцент вирощують на рідкому середовищі при перемішуванні і аерації.
Метод поверхневого культивування має ряд недоліків, серед яких велика трудомісткість робіт, громіздкість обладнання, трудомісткість в контролюванні процесу, його основних параметрів, внаслідок чого кінцевий продукт може мати незадовільну якість і активність. В зв’язку з цим кращим методом є глибинний.
За глибинного методу вирощування легко контролювати оптимальні умови середовища, активність продуценту, накопичення кінцевого продукту. Обладнання для глибинної ферментації має менші об’єми, габарити та оптимізовані таким чином, щоб зменшити трудомісткість процесу біосинтезу[ ].
|
|
|
В залежності від виду ферментації глибинне культивування може бути двох видів: в умовно асептичних та асептичних умовах.
Біосинтез амінокислоти L-аргініну бактерією Escherichia coli здійснюється глибинним способом, оскільки поживні речовини середовища використовуються більш раціонально, що дає можливість значно скоротити затрати на виробництво. До того ж, враховуючи фізіологічні особливості культури E. coli, найкращий синтез амінокислоти вона здійснюватиме за глибинного культивування.
Бактерії E. coli – факультативні анаероби, можуть переходити з дихання (у присутності кисню) на бродіння (за відсутності кисню), але оскільки бродіння не є метою виробництва аргініну, то в середовище повинно постійно поступати стерильне аераційне повітря[].
З метою досягнення високої продуктивності вирощування продуценту амінокислоти процес проводиться в безперервному режимі і рівномірній подачі поживного середовища або його компонентів в залежності від ступеня їх споживання культурою.
Посівний матеріал, вирощений в лабораторних установках розмножують в посівному апараті за температури 37оС і тиску 0,03 – 0,04 МПа при безперервній аерації і перемішуванні на протязі 18 – 24 годин. Готовий посівний матеріал подається в попередньо загружений ферментер.
Культивування проводиться за температури 37 оС, так як вона є оптимальною температурою для нормально росту і розвитку продуценту, рН середовища підтримується в межах 7 – 7,2 за допомогою КОН [].
З метою підвищити вихід аргініну процес ведеться з підживленням. Підживлення подається через 24 – 32 години після посіву за нормального потоку процесу ферментації. Момент подачі і об’єм підживлення визначають по вмісту сахарів в середовищі чи по зниженню значення рН нижче 7,2 [].
Глибинне культивування E. сoli проводиться у ферментері. Він забезпечує можливість проведення процесу культивування продуцента в асептичних умовах при інтенсивній аерації середовища. Повітря для аерації через трубопровід поступає на очищення в індивідуальний фільтр і очищене подається в середовище, а необхідна температура підтримується подачею води в сорочку чи охолоджуючі труби. Для усунення піни, що утворюється в процесі вирощування додається піногасник у вигляді пропінолу та каустику []. У дріжджовій промисловості діє кілька схем вирощування дріжджів. Різниця між ними полягає у періодичності або безперервності процесів, кратності розведення сировини, кількості стадій, швидкості росту, рівню технологічних параметрів (температура, рН, величина засівів) та ін. Але всі існуючі схеми виробництва хлібопекарських дріжджів передбачають постійне накопичення біомаси.
Виробничий біосинтез можна проводити безперервним способом, періодичним способом чи напівбезперервним.
Періодичні процеси біосинтезу – низькопродуктивні, оскільки об’єм культурального середовища в апараті і концентрація біомаси протягом всього процесу не постійні. У культуральному середовищі на кінець процесу накопичуються продукти життєдіяльності клітин, які гальмують їх ріст, при цьому швидкість росту клітин знижується.
Безперервна схема передбачає культивування E. сoli з метою одержання аргініну в батареї апаратів. Недоліком такого біосинтезу є низький ступінь споживання субстрату, а також він використовується лише для великотоннажних виробництв. Такий спосіб не забезпечує високої продуктивності і необхідної якості готового продукту
Отже, біосинтез проводиться в умовах асептичності в періодичному режимі за глибинного культивування і підтримання усіх оптимальних умов культивування.
Розрахунок кількості необхідних стадій підготовки посівного матеріалу
Виходячи із геометричного об’єму виробничого ферментеру та обраного коефіцієнту його заповнення, розраховуємо кількість стадій підготовки посівного матеріалу.
Виробничий біосинтез здійснюють у ферментері об’ємом 100 лз коефіцієнтом заповнення, 0,5.
Робочий об’єм ферментера (Vроб) визначають за формулою:
Vроб.=Vг.ф.×Кзап.,
де: Vг.ф. – геометричний об’єм ферментера;
Кзап– коефіцієнт заповнення, 0,5.
Vроб.=100×0,5 =50 л
Кількість посівного матеріалу (доза) становить 10 % від об’єму поживного середовища. Отже, для одержання 50 лкультуральної рідини потрібно:
Vроб.1=50×0,1=5 лпосівного матеріалу.
Для одержання 5 лкультуральної рідини треба мати:
Vроб.2=5×0,1=0,5 л посівного матеріалу.
Таку кількість посівного матеріалу одержують культивуванням культури штаму Escherichiа coli в качалочних колбах об‘ємом 0,75 дм3. Кількість колб – 5 шт.
Отже, процес одержання посівного матеріалу для забезпечення виробничого біосинтезу аргініну у ферментері об’ємом 100 л з коефіцієнтом заповнення 0,5 буде проходити у 4 етапи.
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 714; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!