Імунохроматографічний метод аналізу.
Імунохроматографічного аналізу(ІХА)- це метод визначення наявності певних концентрацій речовин у біологічних матеріалах (сеча, цільна кров, сироватка або плазма крові, слина, кал і т.д.). Даний вид аналізу здійснюється за допомогою індикаторних смужок, паличок, панелей або тест-касет, які забезпечують швидкість проведення тестування. ІХА - порівняно молодий метод аналізу, він часто позначається в літературі також як метод сухої імунохімії, стрип-тест, QuikStripcassette, QuikStripdipstick, експрес-тест або експрес-аналіз. Ці назви пов'язані з швидкістю проведення цього методу аналізу. Принцип дії імунохроматографічного тесту полягає в тому, що при зануренні тесту в фізіологічну рідину вона починає мігрувати вздовж смужки за принципом тонкошарової хроматографії. Руховою фазою в даному випадку є фізіологічна рідина. Разом з рідиною рухаються і антитіла з барвником. Якщо в цій рідині присутній досліджуваний антиген (гормон, інфекційний або онкологічний маркер), то відбувається його зв'язування, як з першим, так і з другим типом антитіл, що є вже імунологічним методом аналізу. При цьому відбувається накопичення антитіл з барвником навколо антитіл, жорстко іммобілізованих в тест-зоні ІХА-смужки, що проявляється у вигляді яскравої темної смуги. Незв'язана антитіла з барвником мігрують далі вздовж смужки і неминуче взаємодіють із вторинними антитілами в контрольній зоні, де і відбувається друга темна смуга. Взаємодія (і темна смуга) в контрольній зоні повинні виявлятися завжди (якщо аналіз проведений правильно), незалежно від присутності досліджуваного антигену в фізіологічної рідини.Результати визначаються візуально або комп'ютерною обробкою відсканованого зображення.
Швидкі тести для специфічної етіологічної лабораторної діагностики інфекційних хвороб (вірусних гепатитів В і С, ВІЛ-інфекції, туберкульозу, хламідіозу, сифілісу та інших) - це прості у використанні діагностичні набори, які дозволяють отримати результат дослідження протягом декількох хвилин.Вони засновані на тих же принципах імунологічних реакцій, застосуванні таких же імунобіологічних продуктів, що і добре відомі класичні ІФА тест-системи. В різних країнах світу, в тому числі і високо розвинутих, такі тести давно й успішно застосовуються не тільки в інфектології, але й у багатьох інших галузях медицини. Вони необхідні як для поодиноких досліджень, так і в великому їх потоці, коли треба швидко, вірогідно і, що важливо, недорого одержати результат. Сьогодні такі швидкі тести випускають багато фірм-виробників. Впровадження швидкої діагностики на основі імунохроматографічного аналізу підтримують ВООЗ і Глобальний фонд, вони рекомендуються для застосування в міжнародних програмах по контролю за хворобами, що передаються статевим шляхом, в програмах, пов'язаних з ВІЛ-інфекцією/СНІДом та інших. ВУкраїні діагностика інфекційних хвороб із застосуванням зазначених швидких тестів проводиться вже протягом майже 10 років. За цей період основними споживачами виявили себе, насамперед, організації самостійних форм діяльності, консультативні кабінети, сімейні лікарі, лікарі швидкої та невідкладної медичної допомоги. Все більшу зацікавленість до швидких тестів проявляють керівники державних медичних установ і закладів, що мають не досить забезпечені лабораторії, проте бажають одержувати достовірні результати дослідження без використання дорогого устаткування.
|
|
|
|
|
|
Воснові імунохроматографічного аналізу (ІХА) лежить специфічна взаємодія антигенів і антитіл на хроматографічній мембрані після змочування її рідиною досліджуваного зразка або буферним розчином. Така взаємодія відбувається внаслідок дифузного переміщення забарвленого колоїдним золотом (КЗ) індикаторного імунного компоненту ІХА, який заздалегідь нанесений на мембрану, та антигенів або антитіл досліджуваного зразка після нанесення останнього на мембрану. Для візуального виявлення специфічної імунної реакції в певній зоні-смузі хроматографічної мембрани попередньо жорстко сорбовані необхідні відомі компоненти додаткових імунологічних реакцій, які дозволяють сконцентрувати барвник у вигляді забарвленої смуги. Введений у тест-систему "з залишком" індикаторний забарвлений імунний компонент дифундує по хроматографічній мембрані далі від місця проявлення специфічної імунної реакції і зупиняється знов у контрольній смузі внаслідок імунологічної взаємодії з жорстко іммобілізованим там імунним компонентом іншої специфічності. Забарвлення контрольної смуги свідчить про те, що дослідження було проведене коректно.[54,59]
Тест-касета в цих тестах являє собою нітроцелюлозну мембрану, заправлену у пластикову касету, на якій позначені: місце внесення зразка для дослідження, місце появи результатів специфічного тесту (Т), місце розташування контрольної смуги (К), назва маркеру, для виявлення якого розроблений даний швидкий тест. Тест-касета запаяна у пластиковий пакет разом з силікагелем та гепаринізованою піпеткою для внесення зразка. Тобто, надані для дослідження матеріали - це: тест-касета, одноразова піпетка, буфер (тільки для дослідження цільної крові) та інструкція.[4]
|
|
|
Необхідні, але не надані матеріали: пробірки (тільки для венозної крові або сироватки чи плазми), ланцети (для взяття цільної крові з пальця), центрифуга (тільки для плазми), годинник або таймер.Порядок дослідження:Відкрити запаяний пакет, витягнути тест-касету та розмістити на робочому столі горизонтально. Підготувати необхідне устаткування та протокол дослідження.Для зразків суцільної крові з пальця - наповнити піпетку кров'ю та видавити приблизно 50 (мкл) її у лунку S на касеті, після чого додати 1 краплю буферу приблизно 40 (мкл) та зазначити час.
|
|
|
Результат обліковувати через 15 хвилин. Не брати до уваги результати після 20 хвилин.Тлумачення результатів дослідження швидкими тестами вказане у відповідних розділах методичних рекомендацій при детальній характеристиці конкретних специфічних тестів.Тест може оцінюватись, як позитивний, негативний або сумнівний. Як позитивний - при наявності двох чітких забарвлених смуг у зонах Т та К (найчастіше), або як негативний - при наявності однієї забарвленої смуги (червона контрольна смуга) у зоні К. Поява червоної контрольної смуги підтверджує також і те, що був використаний достатній об'єм досліджуваного матеріалу (зразку) та дотримані всі необхідні умови тесту. [4]Тест може оцінюватись як сумнівний тоді, коли контрольна смуга не проявляється (Рис.3).
Рис. 2.2 Результат експрес тесту.
Швидкі тести, які використовують для лабораторної діагностики інфекційних хвороб, мають такі обмеження:1. Вони застосовуються виключно, як методи якісної діагностики (є/немає), і не можуть визначати концентрацію або іншу кількісну характеристику антигенів або титр антитіл.2. Як і у всіх випадках діагностики інфекційних хвороб, результати швидких тестів повинні братися до уваги у сукупності з повнотою наявності клінічної інформації.3. Швидкі тести не виявляють антигенів або антитіл, якщо вони присутні в зразку в кількості, яка знаходиться за межею чутливості методу (наприклад, для визначення HBsAg він має бути в зразку в кількості, не меншій за 1 нг/мл). Тому у випадках, коли результат швидкого тесту негативний, а симптоми певної інфекції наявні, рекомендується додаткове тестування з використанням інших лабораторних методів (ІФА, ПЛР).4. Відносна чутливість більшості швидких тестів дорівнює 99%, відносна специфічність їх близько 98 %.
ПЛР метод дослідження
Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР, PCR) винайшов у 1983 році Кері Мюлліса (американський вчений). Згодом він отримав за це винахід Нобелівську премію. В даний час ПЛР-діагностика є одним з найбільш точних і чутливих методів діагностики інфекційних захворювань.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) — експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) в біологічному матеріалі (пробі).
В основі методу ПЛР лежить багаторазове подвоєння певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (in vitro). В результаті напрацьовуються кількості ДНК, достатні для візуальної детекції. При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку.
КрімпростогозбільшеннячислакопійДНК (цейпроцесназиваєтьсяампліфікацією), ПЛРдозволяєпроводитибезлічіншихманіпуляційзгенетичнимматеріалом (введеннямутацій, зрощенняфрагментівДНК), ішироковикористовуєтьсявбіологічноїтамедичноїпрактиці, наприклад, длядіагностикизахворювань (спадкові, інфекційних), длявстановленнябатьківства, дляклонуваннягенів, введеннямутацій, виділенняновихгенів.
Специфічність і застосування:
ПЛР - метод молекулярної діагностики, який став для ряду інфекцій «золотим стандартом», перевірений часом і ретельно апробовано клінічно. Метод ПЛР дозволяє визначити наявність збудника захворювання, навіть якщо впробі є всього кілька молекул ДНК збудника. ПЛР дозволяє діагностувати наявність довго зростаючих збудників, не вдаючись до трудомістким мікробіологічними методами, що особливо актуально в гінекології і урології при діагностиці урогенітальних інфекцій, що передаються статевим шляхом.
Також, цим методом проводять діагностику вірусних інфекцій, таких як гепатити, ВІЛ та ін .
Специфічність ПЛР при використанні технології PCR навіть для усіх вірусних, хламідійних, мікоплазмових, уреаплазменных і більшості інших бактеріальних інфекцій досягає 100%. Метод ПЛР дозволяє виявляти навіть поодинокі клітини бактерій або вірусів. ПЛР-діагностика виявляє наявність збудників інфекційних захворювань в тих випадках, коли іншими методами (імунологічними, бактеріологічними, мікроскопічними) це зробити неможливо.
Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важко культивованих, некультивованих і приховано існуючих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися при латентних і хронічних інфекціях, оскільки цей метод дозволяє уникнути труднощів, пов'язаних з вирощуванням таких мікроорганізмів у лабораторних умовах.
Застосування ПЛР-діагностики також дуже ефективний відносно збудників з високою антигенною мінливістю і внутрішньоклітинних паразитів. Методом ПЛР можливе виявлення збудників не лише в клінічному матеріалі, отриманому від хворого, але і в матеріалі, одержуваному з об'єктів зовнішнього середовища (вода, грунт і т. д.). В урологічній та гінекологічній практиці - для виявлення хламідіозу, уреаплазмозу, гонореї, герпесу, гарднерельозу, мікоплазменної інфекції ВПЛ - вірусів папіломи людини; в пульмонології - для диференціальної діагностики вірусних і бактеріальних пневмоній, туберкульозу; в гастроентерології - для виявлення хелікобактеріозу; в клініці інфекційних захворювань - в якості експрес-методу діагностики сальмонельозу, дифтерії, вірусних гепатитів В, С і G; в гематології - для виявлення цитомегаловірусної інфекції, онковирусов.
Специфічність ПЛР заснована на утворення комплементарних комплексів між матрицею і праймерами - короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18 - 30 літер. Кожен з праймерів зіставимо (комплементарен) з одного з ланцюгів двохланцюжкової матриці, обрамляючи початок і кінець ампліфікованого ділянки.Після з'єднання (гібридизації) матриці з праймером (відпал), останній служить початком для ДНК-полімерази при синтезі комплементарної ланцюга матриці.
Проведення ПЛР
Для проведення ПЛР в найпростішому випадку потрібні наступні компоненти:
• ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, який потрібно амплифицировать;
• два праймера, комплементарні кінцях необхідного фрагмента;
• термостабільна ДНК-полімераза;
• дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
• іони Mg2+, необхідні для роботи полімерази;
• буферний розчин.
ПЛР проводять в амплифікаторі — приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1°C. Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають масло, наприклад, вазелінове. Додавання специфичеких ферментів може збільшити вихід ПЛР-реакції.
Хід реакції :
Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20 - 35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій. Двухланцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94 - 96°C (або до 98°C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5 - 2 хвилини, щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією — руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами. Іноді перед першим циклом проводять попередній прогрів реакційної суміші протягом 2 - 5 хвилин для повної денатурації матриці і праймерів.Коли ланцюга розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з одноланцюговою матрицею. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від праймерів і зазвичай обирається на 4 - 5°С нижче їхні температури плавлення. Час стадії — 0,5 - 2 хвилин. ДНК-полімераза повторює матричну ланцюг, використовуючи праймер в якості затравки. Це — стадія елонгації.Температура елонгації залежить від полімерази. Часто використовувані полімерази найбільш активні при 72°C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини ампліфікованого фрагмента. Зазвичай час елонгації приймають рівним одній хвилині на кожну тисячу пар підстав. Після завершення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб здобути всі одноланцюгові фрагменти. Ця стадія триває 10 - 15 хв.
Для успішного проведення аналізу важливо правильно зібрати матеріал у пацієнта і правильно провести його підготовку. Відомо, що в лабораторній діагностиці більшість помилок (до 70%) відбувається саме на етапі пробопідготовки. Для взяття крові в лабораторії в даний час застосовуються вакуумні системи, які з одного боку мінімально травмують пацієнта, а з іншого - дозволяють провести взяття матеріалу таким чином, що він не контактує з персоналом, ні з навколишнім середовищем. Це дозволяє уникнути контамінації (забруднення) матеріалу і забезпечує об'єктивність аналізу ПЛР.
До недоліків даного методу можна віднести :
- Дорога вартість обладнення, яке необхідне для проведення аналізу; не кожна лабораторія може собі дозволити ;
- Має бути виділена спеціальна робоча зона де застосовують тільки ПЛР, обов’язково має бути налагоджена система вентиляції, достатня кількість боксів;
- Для виконання даного методу, вимагається особа з відповідною кваліфікацією , що пройшла відповідні курси;
- Ймовірність ампліфікації ДНК не тільки живого, але і загиблого мікроорганізму. При проведенні ПЛР -діагностики для контролю ефективності лікування необхідно дотримуватися певні вимоги. Зокрема, проводити ПЛР потрібно після певного проміжку часу (1-2 місяці), за який відбувається повне зникнення збудника інфекції в організмі.
- Можливість виникнення перехресної реакції. Підбір фрагментів ДНК (праймерів) здійснюється на основі знань про генетичну будову конкретного мікроорганізму. Але теоретично такий самий фрагмент може бути присутнім і в інших мікроорганізмів, геном яких на сьогоднішній день ще не розшифровано. Їх присутність в пробі може призвести до псевдопозитивного результату в оцінці аналізу.
-Ще однією слабкістю аналізу вважається мінливість всіх мікроорганізмів. Це означає, що якість генотипів збудників, які вже мутувалися в організмі, будуть невловимі для тест-системи і ніяка реакція не відбудеться.
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 3137; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!