Метод культивування мікроорганізмів (чашковий)

Визначення кількості мікроорганізмів методом культивування проводиться за такими етапами:

1. підготовка матеріалу для дослідження.

2. методика приготування десятикратних розведень матеріалу.

3. висів у чашки петрі й культивування посівів.

4. облік вирощених колоній й розрахунок кількості мікроорганізмів (в 1 г або в 1 см³ продукту, на 1 см² поверхні, на рука, посуду тощо).

Підготовка матеріалу для дослідження

Характер підготовки матеріалу для мікробіологічного дослідження залежить від його природи, консистенції та інших властивостей.

ü Тверді продукти не розчинні у воді (хліб, сир, печиво та ін.) За чинним стандартом відбирають середню пробу для аналізу. З середньої проби на стерильний папір або скло відбирають наважку. Розмір наважки визначається гаданим ступенем забрудненості продукту. Наважку переносять у стерильну ступку, заливають 1-2 см³стерильної води і ретельно перемішують стерильним макогончиком. Отриману масу переносять у стерильну колбу з визначеним об'ємом стерильної води. Залежно від розміру наважки і кількості води отримують вихідну суспензію або розведення. Наприклад, наважку ковбаси у 10 г перенесли у колбу і долили стерильною водою до позначки 100 см³. Таким чином отримали розведення 1:10. Якби цю ж наважку у 10 г перенесли у пробірку і долили води до об'єму 10 см³, то отримали б вихідну суспензію або так зване пряме розведення.

ü Тверді продукти розчинні у воді (сіль, цукор тощо). Із середньої проби беруть наважку і розчиняють у визначеній кількості стерильної води, щоб отримати розведення 1:10 або 1:100.

ü Рідкі продукти (сік, молоко, вода тощо). Такий матеріал є готовою вихідною суспензією.

ü Поверхні обладнання, посуду, інвентарю (Л/р 11, с. 55).

ü Повітря(Л/р 9, с. 46).

Методика приготування десятикратних розведень матеріалів

Часто буває неможливим підрахувати колонії на чашці Петрі при прямому висіві об'єкта. Щоб зменшити кількість мікроорганізмів при висіві, вихідну суспензію розводять стерильною водою.

1. До пробірок наливають по 10 см³ води і стерилізують в автоклаві (після стерилізації у кожній пробірці залишається 9 см³ води).

2. Стерильною піпеткою беруть 1 см³ підготовленої вихідної суспензії та вносять до пробірки з 9 см³ стерильної води. Таким чином отримують перше розведення суспензії 1:10.

3. Далі новою стерильною піпеткою беруть із першого розведення 1 см³ і вносять таким же чином в наступну пробірку з 9 см³ стерильної води, тобто готують друге розведення 1:100.

4. Аналогічним чином готують третє, четверте і наступні розведення (номер розведення співпадає з кількістю нулів у знаменнику) (рис. 16).

Висів у чашки Петрі й культивування посівів

1. Підписують чашки Петрі (обов'язково зазначають розведення та інші необхідні дані) і висівають в них стерильною піпеткою по 1 см³ відповідного розведення матеріалу, починаючи з найбільшого, тобто з того, де є найменша кількість мікроорганізмів.

2. Посіви заливають стерильним розплавленим і охолодженим до температури 48-50°С поживним середовищем та перемішують круговими рухами, не відриваючи чашку від столу.

3. Після застигання агару чашки перевертають догори дном і ставлять у термостат для культивування мікроорганізмів. Для вирощування МАФАМ використовують МПА (температура 30°С, час – 72 год), для дріжджів і пліснявих грибів використовують сусло-агар (температура 24°С, час – 5 діб).

Рисунок 16 - Схема розведення і висіву дослідного матеріалу при визначенні мікробного числа чашковим методом

Облік вирощених колоній і розрахунок кількості мікроорганізмів

Найкращими для підрахунку вважаються чашки, на яких виросло від 15 до 300 колоній (ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов). В інших джерелах наводяться інші числа: від 50 до 100 [Лерина, Педенеко, 1980] івід 50 до 150 [Градова и др., 2001]. Зазвичай висівають по дві паралельні чашки кожного розведення. Кількість підрахованих колоній помножають на відповідне розведення, беруть середнє арифметичне двох паралельних чашок, потім загальне середнє арифметичне всіх підрахованих чашок і, таким чином, отримують остаточний результат, тобто вміст мікроорганізмів в 1 см³ вихідної суспензії. Знаючи об'єм суспензії та масу наважки, взятої для її приготування, вираховують кількість мікроорганізмів в 1 г або в 1 см³ продукту.

Приклад. На двох паралельних чашках при розведенні 1:10 виросла велика кількість колоній, які неможливо підрахувати. На чашках із розведенням 1:100 виросло відповідно 270 і 230 колоній, при розведенні 1:1000 - 15 і 20, при розведенні 1:10 000 - 2 і 5 колоній. У цьому випадку відбираємо для підрахунку чашки з розведеннями 1:100 і 1:1000. Підраховану кількість колоній множимо на розведення і беремо середнє арифметичне:

[(270х100)+(230х100)]:2=25000 і [(15х1000)+(20х1000)]:2=17500.

Чашки з розведенням 1:10000 не враховуємо, тому що на них виросло менше 15 колоній.

Визначаємо кількість мікроорганізмів як середнє арифметичне усіх чашок, які були взяті для підрахування: (25000+17500):2=21250=2,13х10⁴.

Кількісний облік мікроорганізмів за допомогою пластини Лафара і камери Вольфюгеля:

Пластина Лафара - це кругла скляна пластина, розподілена на сегменти та сектори (їх 6), діаметр кола дорівнює діаметру чашки Петрі (10 см). Пластину накладають на чашку Петрі так, щоб її центр співпадав з центром чашки Петрі.

При рівномірному розподілі мікроорганізмів підраховують їх кількість в одному секторі та помножують на 6. Якщо колоній багато і вони на чашці Петрі розташовані нерівномірно, то підраховують колонії у 3-4 секторах, а потім перераховують на всю площу чашки Петрі та визначають їх кількість.

Камера Вольфюгеля складається з 144 квадратів (S=1 см²), по діагоналі кожні квадрати розподілені на 9 малих квадратів. За допомогою лупи підраховують кількість колоній у 12 квадратах: 4 - в центрі та 8 – периферійних і записують число колоній у кожному квадраті. Отриману суму поділяють на число підрахованих квадратів і знаходять кількість мікроорганізмів у 1 см². Наприклад, якщо всього в 12 квадратах підраховано 232 колонії, то середня кількість колоній на 1см² буде складати приблизно 19 (232:12). Для визначення числа колоній по всій чашці Петрі треба кількість колоній в 1см² помножити на площу чашки Петрі, яка дорівнює 78,6 см². Таким чином, загальне число колоній в чашці Петрі буде дорівнювати 1520 (19 х 78,6).

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 1329; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 7 8 9 10 111213 14 15 16 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!