Иммунохимические методы анализа, их классификация
Иммунохимические методы основаны на селективном обратимом нековалентном связывании антигенов антителами. Эти методы используются для обнаружения и количественногo определения как антигенов, так и антител. Факт образования комплекса антигена с антителом и количество этогo комплекса могут быть определены различными путями. Могут использоваться методы с мечеными или немечеными реагентами.
В методах с использованием меченых в-в могут применяться подходящие метки, например, ферменты, флуорофоры, люминофоры и радиоизотопы.
В настоящее время разработаны различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа:
1. «Сэндвич»-метод. На тв фазе адсорбированы АТ к исследуемому АГ. После инкубации исследуемого материала и образования комплекса «АТ – АГ» проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется конъюгат, т.е. АТ к искомому АГ, меченые ферментом. По завершении инкубации, с последующим удалением непрореагир. коньюгата промывкой, образуется комплекс, в котором АГ как бы заключен между двумя слоями антите. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата. «Сэндвич»-метод используется для выявления HBsAg, HBeAg, АГвируса гепатита А.
В качестве ферментов-меток наиболее часто выступают пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и β-D-галактозидаза. В качестве субстрата могут быть о-фенилендиамин, тетраметилбензидин.
|
|
|
В ИФА наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие в-ва, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают видимый свет.
2. Непрямой ИФА. На твердой фазе иммобилизуют АГ, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом АТ к Ig человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом к IgG. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии АТ уровень оптич плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов. Этот метод применяется для определения АТ к вирусу гепатита С.
3. Конкурентный метод. К АГ, иммобилизованному на твердой фазе, одновременно добавляют исслед материал и конъюгат. При проведении реакции меченые и исследуемые АТ конкурируют за активные центры АГ, иммобилиз на твердой фазе. После завершения инкубации и удаления не прореагировавших компонентов проводится ферментативная реакция, результаты которой обратно пропорциональны количеству АТ в ио.
|
|
|
4. Ингибирующий ИФА. На полистироловом шарике адсорбирован стандартный АГ, после инкубации с исследуемым материалом и удаления непрореагировавших компонентов добавляется АГ, меченный ферментом, который взаимодействует со свободными центрами связывания антител, провзаимодействовавшими с антигеном, сорбированным на твердой фазе. При наличии антител в исследуемой пробе уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных контрольных образцов.
5. Прямой ИФА. На первом этапе реакции исследуемый образец фиксируют на твердой фазе. Затем к нему добавляют конъюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию исследуемых антигенов в образце и вообще говорит об их наличии в исследуемом материале.
Методы с использованием немеченого антитела или антигена
Методы иммунопреципитации включают процессы флокуляции и осаждения. При смешивании р-ров АГ с соответствующим АТ в подходящих условиях реактанты образуют флокулирующие (образуются рыхлые хлопья) или преципитационные (помутнение среды) aгpeгaты. Иммунопреципитация может оцениваться визуально или по светорассеяниию (нефелометрическое и турбидиметрическое определение).
Может также использоваться иммунодиффузия, когда в агаре в точке взаимодействия антигена и антитела образуется осадок. Их движение может быть спровоцировано электрическим полем (иммуноэлектрофоретические методы).
Билет
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 573; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!