Моноклональные антитела, общие биотехнологические подходы к получению
МАТ для мед прим – это препараты иммуноглобулина или фрагмента иммуноглобулина, например, F(ab')2, с определенной специфичностью, выработанные одним клоном клеток.
1. Выделение Т-лимфоцитов по их розеткообразованию с эритроцитами барана
Лейковзвесь выделяют на градиенте плотности и центрифугируют при комнатной t в течение 40 мин при 300g. Мононуклеары отделяют и промывают средой 199. Затем смешивают с эритроцитами барана и эмбриональной телячьей сывороткой. Смесь инкубируют 15 мин при 37ºС, центрифугируют при 150g в течение 5 мин и инкубируют при 4ºС 12–16 ч. Затем проводят осторожно суспендирование клеток и их наслаивание на градиент фикол-верографин и центрифугируют. Розетки осаждаются на дно. При помощи гипотонического р-ра их разрушают. Выделенные Т-клетки используют для иммунизации животных.
2. Иммунизация мышей и получение клеток селезенки(Иммунизацию мышей линии BALB/b (инбредные мыши, генетически сходныепо отношению к плазмоцитоме) проводят путем введения им в хвостовую вену 2000 Т-клеток. Проводят 5 раз с интервалом 2 недели. Последнюю иммунизацию проводят за 4–5 дней до извлечения селезенки. Извлекают селезенку в асептических условиях, гомогенизируют и процеживают через ткань, промывают средой 199 2–3 раза.
3. Подготовка миеломных клеток(Клетки мышиной миеломы поддерживают в культуральной среде, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамин и гентамицин.)
|
|
|
4. Слияние клеток, получение гибридом
5. Селекция гибридных клеток на среде ГАТ – отбор штаммом продуцентов (определение антителообразующей способности гибридом)
6. Клонирование(Фидер(слой поддерживающих клеток) получают путем гомогенизации органов(селезенки и тимуса), процеживания через ткань и их помещения в лунки планшета со средой 199. Через 3–7 суток образуемся слой, используемый как фидер. Клетки клона разводят до 50 клеток в 10 мл и помещают в лунки. Видимые колонии возникают через 10–14 дней).
7. Консервирование гибридом(Гибридомы в логарифмической фазе извлекают из лунок, выдерживают в среде с 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 50–70 г/л диметилсульфоксида. Клетки сначала выдерживают при 2–4ºС в сосуде Дьюара в течение 1–3 ч и затем переносят в жидкий азот.)
8а. Затем клетки из банка продуцентов извлекают, предварительно подготавливают и помещают в биореакторы для ферментации. После чего разделяют биомассу и культуральную жидкость, в которой содержатся МАТ, очищают жидкую часть.
8б. Получение гибридом из асцитической жидкости (культивирование гибридом invivo)За 3–10 дней до инокуляции гибридом мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл вазелинового масла для индукции роста гибридом в асцитной среде. 107 клеток гибридом ICO-90 внутрибрюшинно вводят. Через 7–8 дней собирают асцитную жидкость. Центрифугируют ее при 4ºС в течение 20 мин при 2500g. В надосадочной жидкости содержатся МАТ в наибольшей концентрации.
|
|
|
9. Выделение и очистка моноклональных антител(Выделяют путем аффинной хроматографии на А-сефарозе.)
Преимущества культивирования клеток растений перед традиционными способами. Генотип материнского растения.
Преимуществами использования культивируемых клеток высших растений:
а) способность клеток синтезировать используемые продукты растительного происхождения;
б) возможность созд новых продуктов, лучше традиционных, открывающих новые области применения;
в) возможность биотрансформации дешевых предшественников в конечный ценный продукт;
г) возможность получения продукта независимо от климата, сезона, погоды, почвенных условий;
д) унификация и оптимизация условий выращивания;
е) перспективы полной автоматизации и компьютеризации процессов.
Генотип материнского растения. Генотип родительского растения, (донора экспланта), существенно влияет на биосинтетический потенциал культивируемых клеток. М. Ценк с сотрудниками для получения культуры барвинка розового собрал 184 образца семян и из проростков семян отобрали те, которые содержали наибольшее количество индольных алкалоидов серпентина и аймалицина. Из этого материала получили каллусные культуры, содержащие указанные алкалоиды в 4–5 раз больше.
|
|
|
Однако У. Реллер не обнаружил подобной зависимости в образовании серпентина каллусными культурами, полученными из разных растений барвинка розового. Японские исследователи также не наблюдали корреляции между содержанием берберина в интактных экземплярах василистника и содержанием этого алкалоида в его каллусных культурах.
Большинство исследователей учитывают генетическую характеристику ткани – экспланта. В качестве экспланта используется не только ткань, богатая искомым в-вом, поскольку высокая концентрация в-ва может отражать накопление его в ткани. Поэтому выбор органа растения для введения его в культуру имеет немаловажное значение.
Следует подчеркнуть, что гены регулирующие биосинтез вторичных метаболитов, присутствуют и в клетках их не продуцирующих. В некоторых случаях биосинтетические способности культуры клеток восстанавливались при регенерации растений. Например, культура клеток наперстянки при длительном культивировании утрачивала способность к синтезу гликозидов, а растения, регенерированные из этой культуры, восстанавливали их биосинтез. Таким образом, генетическая информация в клетках сохраняется, но для ее реализации требуются специфические условия. Следовательно, культивируемые клетки, изолированные из высокопродуктивных растений и тканей, содержат необходимую генетическую информацию для биосинтеза вторичных метаболитов.
|
|
|
Билет
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 200; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!