Основные этапы создания трансгенных организмов. Получение рекДНК

Этапы:

1. Получение (выделение) нужного гена (трансгена), намеченного для переноса.

2. Конструирование рекомбинантной ДНК (рекДНК).

3. Генетическая трансформация, т.е. перенос и включение рекДНК, содержащей трансген, в клетки реципиента.

4. Молекулярная селекция – отбор трансформантов, т.е. клонов, несущих рекДНК.

II этап.Фрагменты рекомбинантных ДНК и вектора «сшивают» одним из трех основных методов, в зависимости от того, какие концы имеют фрагменты – «тупые» или «липкие».

Сшивка по одноименным «липким» концам (рестриктазно-лигазный метод)

Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут «слипаться» за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов. После такого спаривания полная целостности двойной спирали не восстановится, т.к. останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления (сшивания или лигирования нитей) используют фермент ДНК-лигазу.

Сшивка по «тупым» концам (коннекторный метод)

«Тупые» концы могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и фермент, и «тупые» концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при «сшивке» по «липким» концам.

Сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами

Когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, некомплементарные друг другу «липкие» концы, применяют линкеры (или «переходники»). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют большие наборы таких генных «переходников». При использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры «тупой конец - липкий конец».

Тест «Аномальная токсичность».

Если в частной статье нет других указаний, каждой из пяти здоровых мышей массой от 17г до 24 г внутрибрюшинно вводят одну человеческую дозу, но не более 1,0 мл. Человеческая доза указана на этикетке или листке вкладыше испытуемогo образца. Животных наблюдают в течение 7 дней.

Испытуемый образец выдерживает испытание, если ни одно из животных не обнаруживает признаков недомогания. Если погибает более одного животного, испытуемый образец не выдерживает испытание. Если одно из животных погибает или обнаруживает признаки недомогания, испытание повторяют. Испытуемый образец выдерживает испытание, если ни одно из животных второй группы не погибает и не обнаруживает признаков недомогания в течение указанного промежутка времени.

Испытание также должно быть проведено на двух здоровых морских свинках массой от 250 r до 400 r. Внутрибрюшинно вводят каждому животному одну человеческую дозу, но не более 5,0 мл. Человеческая доза указана на этикетке или листке вкладыше испытуемогo образца. Животных наблюдают в течение 7 дней.

Билет

Основные этапы создания трансгенных организмов. Генетическая трансформация.

Процесс создания трансгенного организма достаточно сложен и часто требует индивидуального подхода. Однако в любом случае его можно подразделить на несколько общих этапов:

1) Получение (выделение) нужного гена (трансгена), намеченного для переноса.

2) Конструирование рекомбинантной ДНК (рекДНК).

3) Генетическая трансформация, т.е. перенос и включение рекДНК, содержащей трансген, в клетки реципиента.

4) Молекулярная селекция – отбор трансформантов, т.е. клонов, несущих рекДНК.

III этап.Введение нового (рекомбинантного) гена в клетку можно провести двумя способами: используя вектор или путем прямого введения.

Вектор – молекула ДНК или РНК, способная переносить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом (хромосомой). Не каждая молекула ДНК или РНК может быть вектором.

Векторы должны обладать определенными свойствами, в числе которых:

1) способность к автономной репликации в клетке реципиента;

2) наличие области, в которую возможно встраивание необходимого фрагмента ДНК. Для этого вектор должен содержать один или более сайтов рестрикции;

3) небольшой размер, так как при длине более 15 т.п.н.

4) наличие маркерных генов, позволяющих отличить трансформированные клетки от исходных. Это могут быть селективные (придающие клеткам устойчивость к антибиотикам, гербицидам) или репортерные (клетки удобно тестировать по изменению окраски продуктов этих генов) гены;

5) наличие соответствующего промотора, под который необходимо поместить чужеродный ген для экспрессии в клетке бактерии.

Существует несколько типов векторов: бактериальные плазмиды, вирусы. Существуют гибридные векторы, содержащие ДНК фага и плазмиды. К ним относятся космиды и фазмиды. В качестве векторов можно исп. хлоропластную и митохондриальную ДНК. Транспозоны - участки ДНК в другой вырез.из исходного сайта и внедр. В новый сайт хромосомы или плазмиды. В качестве векторных молекул могут также применяться искусственные хромосомы дрожжей и бактерий.

Методы прямого введения генов в клетку: трансформация, трансдукция, трансфекция, микроинъекция, электропорация, метод «мини-клеток», упаковка в липосомы, электронная пушка.

Трансформация– метод введения рек. ДНК в клетку благодаря увеличению проницаемости ее клеточной оболочки. Клетки обрабатывают ледяным раствором CaCl_2,а затем выдерживают при температуре 42 ⁰Св течение 1,5 мин.

Трансдукция– процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом.

При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза. Для трансфекции используется и ДЭАЭ-декстран, полимер, адсорбирующий ДНК

Электропорация– метод заключается в воздействии импульсов высокого напряжения на мембрану, которое, скорее всего, вызывает временное образование большого количества пор, что обратимо увеличивает проницаемость мембран..

Микроинъекция ДНК позволяет с помощью тонких микроигл и микроманипулятора вводить в клетку или прямо в ядро векторную ДНК с включенным в нее трансгеном. «Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.

Метод биологической баллистики (биолистики) . на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора. Бомбардировку осуществляют с помощью генной пушки за счет перепада давления или под действием электрического разряда. При достаточной скорости частицы металла с напылением могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Часть клеток, которые находятся в чашке Петри в центре под пушкой, гибнет, а часть, расположенная по периферии чашки, выживает и трансформируется.

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 1708; Мы поможем в написании вашей работы!
Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!