Условия и способы культивирования животных клеток и клеток человека
Билет
Особенности культивирования животных клеток и клеток человека.
Требования при культивировании клеток животных и человека: клетки должны преобладать в культуре, быстро адаптироваться к новым условиям, быстро расти, должны соблюдаться стерильные условия культивирования, питательные среды должны быть стерильны и изготавливаться на стерильной воде.
Направления культивирования животных клеток:
- культуры клеток;
- культуры тканей и органов.
Характеристики культур клеток животных. Клетки лишены структурной организации, теряют исходные гистологические и биохимические признаки, т.е. с ними происходят следующие изменения:
- потеря способности к дифференциации;
- происходит дегенерация (перерождение);
- происходит трансформация.
Клетки могут выдерживать не более 50 удвоений, затем они умирают от старости.
Рост клеток (пролиферация) – связан с увеличением биомассы - число клеток, умноженное на среднюю массу клеток. Клетки животных обычно в своей массе не увеличиваются, т.к. их масса удерживается в определенных пределах за счет регуляторных процессов и когда говорят о росте животных клеток, то подразумевают только увеличение их числа (гиперплазия), а не гипертрофия – увеличение массы клетки.
Трансформация - изменение ростовых свойств культивируемых клеток. Может быть вызвана генетическими, химическими, радиоактивными факторами. Трансформированные клетки не имеют ограничений в росте и продолжительности жизни. Повышенная способность к росту означает, что трансформация преобладает над процессом старения.
|
|
|
Культивирование тканей и органов. Тканевая культура состоит из экспланта и зоны роста. Огранная культура – культура, в которой эмбрионы, зачатки органов, целые органы поддерживаются так, чтобы обеспечить дифференциацию и сохранить структуру и функции.
Первичная культура. Источники первичной культуры: органы, экспланты, клетки, непосредственно извлеченные из организма. К такой культуре относятся опухолевые клетки, образованные культивированными клетками, введенными в организм животных.
Перевиваемая культура – культура, подвергавшаяся переносу из одного сосуда в другой. Это обеспечивает возможность продления существования культуры, клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. После нескольких пересевов клеточная линия либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией.
Тест «Стерильность». Метод прямой инокуляции.
Испытание на стерильность выполняют в асептических условиях. Меры предосторожности против контаминации, не должны влиять ни на один из МО, обнаруживаемых в ходе испытания. Рабочие условия контролируются путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны, проведением соответствующих контрольных испытаний.
|
|
|
Для исследований стерильности используют питательные среды. Жидкая тиогликолевая среда предназначена для культивирования анаэробных бактерий, а также пригодна для обнаружения и аэробных бактерий (Нагревают на водяной бане перед использованием и инкубируют при температуре от 30 до 35ºС в анаэробных условиях). Среда на основе гидролизатов соевых бобов и казеина(Инкубируют при температуре от 20 до 25 ºС), и среда Сабуро(Инкубируют при температуре от 20 до 25 ºС) подходит для культивирования как грибов, так и аэробных бактерий.
Среды проверят на ростовые свойства для аэробов, анаэробов и грибов. Используют стандартные штаммы МО. Выращивают в определенных температурных условиях не более 3 (для бактерий) и 5 (для грибов) дней. Среды являются пригодными при условии наличия четкого визуально наблюдаемого роста микроорганизмов.
Сами среды проверяют на стерильность путем культивирования в течение 14 дней. Роста микроорганизмов не должно быть.
Для проверки стерильности используют методы мембранной фильтрации и прямой инокуляции.
|
|
|
Метод прямой инокуляции. Прямое внесение продукта в среду. Объем вносимого продукта должен составлять не более 10% объема среды, если нет других указаний. Для масляных жидкостей добавляют эмульгатор. Для гелей и мазей проводят разбавление 1 к 10 с добавлением эмульгатора.
Инокулированную среду инкубируют в течение не менее 14 дней. Состояние культур оценивают несколько раз в течение инкубационного периода. Инокулированные среды, содержащие масляные продукты, ежедневно осторожно встряхивают. Для анаэробов встряхивание минимализируют.
Если внесение испытуемого материала приводит к помутнению питательной среды, вследствие чего наличие или отсутствие микробного роста не может быть легко определено визуально, следует через 14 дней после начала инкубации перенести порции в другие сосуды, содержащие свежую аналогичную среду, и инкубировать исходные сосуды и сосуды с перенесенными порциями в течение 4 дней.
Если признаков микробного роста не обнаруживается, то продукт признают выдерживающим испытание на стерильность. При наличии признаков микробного роста продукт не выдерживает испытание на стерильность.
Если результаты испытания признаны недостоверными, испытание повторяют, используя то же количество образцов, что и в первоначальном испытании. Если признаков микробного роста в ходе повторного испытания не обнаруживается, то продукт признают выдерживающим испытание на стерильность. Если в ходе повторного испытания обнаруживается рост, то продукт не выдерживает испытание на стерильность.
|
|
|
Минимальное количество единиц продукции для испытания в зависимости от размера серии указано в специальной таблице ГФ РБ.
Билет
Условия и способы культивирования животных клеток и клеток человека.
Условия, способствующие размножению клеток: их низкая плотность, невысокая концентрация Ca2+, присутствие ростовых факторов.
Высокая плотность клеток и концентрация Ca2+, присутствие индукторов дифференциации (гормоны, например гидрокортизон; ретиноиды), полярные р-рители (диметилсульфоксид) способствуют прекращению клеточного деления и индуцируют дифференциации клеток.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 512; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!