Тест «Бактериальные эндотоксины». Турбодиметрический способ
ИБЭ проводят для опред. наличия или количества эндотоксинов, источником к-рых явл. Грамм- бактерии, с исп. лизата амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus или Tachypleus tridеntаtus). Сущ. 3 способа проведения исп-ния: способ гель-тромба, основанный на обр. геля; турбидиметрический способ, основанный на помутнении в результате расщепления эндогенного субстрата; хромогенный способ, основанный на появлении окраски после расщепления синтетического пептидно-хромогенного комплекса.
Турбодиметрический способ. Фотометрическое испытание, основанное на измерении увеличения степени мутности. В зависимости от исп. подхода с исп. данного метода могут быть проведены турбидиметрическое испытание методом конечной точки и кинетическое турбидиметрическое испытание.
Турбидиметрический метод конечной точки основан на количественном соотношении между конц. эндотоксина и степенью мутности (выражающейся в пропускании или поглощении света) реакционной смеси в конце инкубационного периода.
Кинетическое турбидиметрическое испыт. заключается либо в измерении времени, требующегося для достижения заданного значения поглощения в реакционной смеси, либо в определении скорости увеличения степени мутности.
Билет
Основные ферменты, применяемые в генной инженерии. Строение гена про- и эукариот.
Ферменты, используемые в технологии рекомбинантных ДНК, выделяют из клеток бактерий и используют для «разрезания» и «сшивания» фрагментов ДНК прокариотических и эукариотических клеток. Выделяют несколько групп:
|
|
|
1. ферменты, с помощью которых «вырезают» фрагменты ДНК (рестриктазы);
2. ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (ДНК-полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы, ревертазы);
3. ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
4. ферменты, изменяющие строение концов фрагментов ДНК.
Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции). Самая первая рестриктаза Eco RI была выделена из E. сoli. Эти высокоспецифичные ферменты узнают и расщепляют определенные последовательности азотистых оснований в молекуле ДНК (сайты рестрикции- палиндромные последовательности нуклеотидных оснований, которые одинаково читаются вперед и назад). Палиндромы могут быть любых размеров(чаще 4,5,6, реже 8). В результате действия рестриктаз образуются фрагменты (рестрикты) ДНК, где на концах одна цепь длиннее другой, что образует своеобразный «хвост». Такие концы (хвосты) получили название «липких» концов, т. к. они способны к самокомплементарности. Также могут образовываться и «тупые» концы.
Обратные транскриптазы, ДНК-полимеразы – ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК. В генной инженерии часто используется ДНК-полимераза I, выделенная из клеток Е. coli . Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи и имеет 3-х доменную структуру.
|
|
|
РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) – это фермент, который используют для синтеза комплементарной цепи ДНК на базе мРНК.
Лигазы– ферменты, которые «сшивают» фрагменты ДНК за счет фосфодиэфирных связей, образующихся между 3'-ОН концевой группой одного фрагмента и 5'-фосфатной гр. другого фрагмента. ДНК-лигазы необходимы в естественных условиях в процессах репарации и репликации ДНК.
К ферментам, изменяющим строение концов фрагментов ДНК, относится щелочная фосфатаза (отщепляет от линейного фрагмента молекулы ДНК 5'-фосфатные группировки, что снижает количество образующихся нежелательных комбинаций фрагментов ДНК),нуклеаза Bal 31 – это фермент, неспецифически удаляющий нуклеотиды из последовательности ДНК.
Строение гена. Прокариоты имеют простую структуру генов. Структурный ген бактерии, фага или вируса, контролирует одну ферментативную реакцию. Специфичным для прокариот является оперонная система организации нескольких генов. Оперон-участок генетического материала, сост. из 1, 2 и более сцепленных структурных генов, которые кодируют белки (ферменты), осуществляющие последовательные этапы биосинтеза какого-либо метаболита. Гены одного оперона расположены в кольцевой хромосоме бактерии рядом и контролируют ферменты, осуществляющие последовательные или близкие реакции синтеза (лактозный, гистидиновый). Структура генов у бактеориофагов и вирусов схожа с бактериями, но усложнена и сопряжена с геномом хозяев.
|
|
|
Эукариотические гены, имеют прерывистое мозаичное строение. Кодирующие последовательности (экзоны) перемежаются с некодирующими (интронами). Структурные гены эукариот имеют более длинную нуклеотидную последовательность, чем соответствующая зрелая иРНК, последовательность нуклеотидов в которой соответствует экзонам.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 259; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!