Тест «Бактериальные эндотоксины». Хромогенный способ
ИБЭ проводят для опред. наличия или количества эндотоксинов, источником к-рых явл. Грамм- бактерии, с исп. лизата амебоцитов мечехвоста. Способы проведения исп-ния: способ гель-тромба, основанный на обр. геля; турбидиметрический способ, основанный на помутнении в результате расщепления эндогенного субстрата; хромогенный способ, основанный на появлении окраски после расщепления синтетического пептидно-хромогенного комплекса.
Хромогенный способ. Основан на измерении количества хромофора, высвоб. из соответ. хромогенного пептида в результате р-ции эндотоксинов с лизатом. В зависимости от исп. подхода с исп-ем данного способа могут быть проведены хромогенное испытание методом конечной точки и кинетическое хромогенное испытание.
Хромогенный метод конечной точки основан на колич. соотношении между конц.эндотоксина и колич. хромофора, высвоб. к концу инкубационного периода.
Кинетическое хромогенное испытание закл. либо в измерении времени, треб. для достижения заданного значения поглощения в реакционной смеси, либо в определении скорости появления окраски.
Расчеты в обоих методах ведут по градировочной прямой.
Билет
Основные этапы создания трансгенных организмов. Получение трансгена.
Этапы:
1. Получение (выделение) нужного гена (трансгена), намеченного для переноса.
2. Конструирование рекомбинантной ДНК (рекДНК).
3. Генетическая трансформация, т.е. перенос и включение рекДНК, содержащей трансген, в клетки реципиента.
|
|
|
4. Молекулярная селекция – отбор трансформантов, т.е. клонов, несущих рекДНК.
I этап. Ген может быть выделен из естественных источников или из геномной библиотеки; синтезирован искусственно – химическим или ферментативным путем.
После проведения фрагментации ДНК из смеси выделяют ДНК-фрагменты (ДНК-рестрикты).Для разделения ДНК-рестриктов прибегают к электрофорезу. Разделение основано на различии в размерах и константных отношениях электрический заряд-масса. Фрагменты в электрическом поле мигрируют в ходе электрофореза при частоте, зависящей от их размеров (массы). Чем больше (длиннее) фрагмент, тем медленнее он мигрирует в электрическом поле. Материалами, в которых проводят электрофорез, являются незаряженная агароза и полиакриламид. Для идентификации используют этидий бромид, который окрашивает фрагменты ДНК.Результативность электрофореза очень высока.После электрофореза фрагменты смывают с агарозы при помощи подходящих методов.
Выделенные после электрофореза из агарозных гелей фрагменты ДНК можно предварительно подвергнуть секвенированию, т. е. определить в них нуклеотидную последовательность. Для этого используют химический и ферментативный методы секвенирования.
|
|
|
Химический метод основан на получении меченных радиоактивным фосфором (Р32) фрагментов и удалении из этих фрагментов одного из оснований. Ферментативный метод основан на том, что в конец анализируемого фрагмента вводят нуклеотид, используемый затем в синтезе разных фрагментов invitro, анализируемых на нуклеотидную последовательность электрофоретически.
Тест «Пирогенность»
Испытание состоит в измерении роста температуры тела, вызванною у кроликов внутривенным введением стерильного раствора испытуемого образца.
Используют здоровых взрослых кроликов обоего пола массой не менее 1,5 кг получавших полноценное сбалансированное питание, не включающее антибиотиков, масса тела которых не снижалась в течение недели, предшествующей испытанию.
Испытание проводят в тихом помещении, где отсутствует риск возникновения помех, которые могут возбудить животных, и в котором температура поддерживается на уровне, не более чем на 3ºС отличающемся от температуры, поддерживаемой в месте постоянного содержания кроликов или в помещении, в котором кролики содержались в течение не менее 18 ч до начала испытания.
|
|
|
Используют термометр или электрическое устройство, показывающее температуру с точностью до 0,1ºС, вводя его в прямую кишку кролика на глубину около 5 см.
Испытание проводят с использованием группы из трех кроликов. Испытуемую жидкость перед введением нагревают до температуры около 38,5 ºС. Испытуемый продукт может быть растворен или разведен в апирогенном растворе 9 г/л хлорида натрия Р. Раствор медленно вводят в крайнюю вену уха каждого из кроликов в течение не более 4 мин. Вводимый объем должен составлять не менее 0,5 мл и не более 10 мл на 1 кг массы тела.
За «исходную температуру» каждого из кроликов принимают среднее из двух значение температуры, записанных для данного кролика с интервалом 30 мин в течение 40 мин, предшествующих введению испытуемого продукта. «Максимальная температура» каждого из кроликов – самая высокая температура, записанная для данного кролика в течение 3 ч после введения. Температуру каждого из кроликов записывают с интервалами, не превышающими 30 мин, начиная не менее чем за 90 мин до введения испытуемого продукта и продолжая в течение 3 ч после введения. За результат испытания принимают разность между максимальной и исходной температурами каждого из кроликов.
|
|
|
После проведения испытания на группе из трех кроликов его при необходимости повторяют на других группах из трех кроликов (суммарно до четырех групп, в зависимости от полученных результатов). Если суммированный результат, полученный в первой группе, не превышает значение, данное во второй колонке таблицы ГФ РБ, считают, что продукт выдерживает испытание. Если суммированный результат превышает значение, данное во второй колонке таблицы, но не превышает значение, данное в третьей колонке таблицы, испытание повторяют, как указано выше. Если суммированный результат превышает значение, данное в третьей колонке таблицы, считают, что продукт не выдерживает испытание.
Билет
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 388; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!