Оценка противовирусной активности интерферона

⇐ ПредыдущаяСтр 6 из 14Следующая ⇒

Противовирусная активность должна составлять от 2×10⁷ до 2×10⁸ МЕ/мл. Определение осуществляют в первичной культуре клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, в перевиваемой культуре клеток почки быка (МДВК) или другой перевиваемой культуре клеток, высокочувствительных к интерферону альфа-типа.

Клетки выращивают в виде монослоя в стеклянных матрацах вместимостью 0,5 л. Для культивирования клеток используют питательную среду 199 или RPMI 1640 с 10 % телячьей сыворотки (среда № 1), 100 ед/мл пенициллина и 10 ед/мл гентамицина.

Тестирование выполняют в 96-луночных плоскодонных пластиковых планшетах.Для засева используют 3-4 суточную культуру с вполне сформированным клеточным монослоем. Клетки суспендируют в 10 мл среды 199 или RPMI 1640 с 5 % телячьей сыворотки. Отбирают пробу для подсчета количества клеток в 1 мл среды в камере Горяева. Суспензию клеток разводят средой таким образом, чтобы в 1 мл содержалось около 5×10⁵ клеток.

Образцы исследуемой субстанции разводят в 5% телячьей сыворотке. Сначала готовят десятикратные разведения до концентрации 10^-3, а затем непосредственно в лунках планшета в объеме 0,1 мл делают двукратные разведения до разведения, близкого к предполагаемому титру активности. Параллельно разводят рабочий стандартный образец (СО), активность которого выражена в МЕ. На каждое разведение используют не менее 4 лунок. 4 лунки оставляют для контроля клеток, 16 - для контроля дозы индикаторного вируса.

Затем к каждой из 96 лунок вносят по 0,1 мл клеточной суспензии в концентрации (5±1)×10⁵ клеток в 1 мл среды. Планшеты с опытными и контрольными культурами инкубируют на протяжении 24 часов при t (37,0±1,0)ºС в атмосфере (5±0,5) % СО₂ и (70±5) % влажности.

После этого среду из лунок удаляют. К каждой лунке с исследуемыми материалами вносят предварительно определенную дозу вируса везикулярного стоматита, которая соответствует 100 условных единиц активности в 0,1 мл. Одновременно осуществляют контроль взятой дозы вируса на предназначенных для этой операции 16 лунках с культурой. Используют по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 0,1 условных единиц активности с коэффициентом разведения 10.

После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы, культуру клеток инкубируют при t (37,0 ±1,0)°С, (5,0±0,5) % СО₂ и (70±5) % влажности.

Учет определения активности интерферона осуществляет через 24-48 часов, когда доза внесенного вируса соответствует 100 условных единиц активности.

Учет результатов проводят в случае отсутствия дегенерации в контрольной культуре.

За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса.

Пересчет активности интерферона (X) в МЕ выполняется по формуле:

Билет

Основные этапы создания трансгенных организмов. Молекулярная селекция.

1) Получение (выделение) нужного гена (трансгена), намеченного для переноса.( из естеств. Источников или из геномной библиотеки, синт. Химически)

2) Конструирование рекомбинантной ДНК (рекДНК).( сшивка по одноименным липким концам, сшивка по тупым концам, по разноименным липким концам)

3) Генетическая трансформация, т.е. перенос и включение рекДНК, содержащей трансген, в клетки реципиента.( исп. Вектор или метод прямого введения)

4) Молекулярная селекция – отбор трансформантов, т.е. клонов, несущих рекДНК.

IVэтап.Молекулярная селекция.Для посл. Идентиф. Трансформир. клеток, несущих рек. ДНК, вектор должен содержать один или несколько генов-маркеров. Выделяют две группы маркерных генов, позволяющих отличить трансформированные клетки от исходных, - это селективные и репортерные гены:

Селективные гены – придают клеткам селективное преимущество, т.е. устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.) или гербицидам.работы у такого маркера – способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде с добавкой определенных веществ, ингиб. рост и деление нетрансформированных клеток. Например, в присутствии гена лактомазыбактер. клетка обретает устойчивость к ампициллину и на среде с этим антибиотиком образует колонии, тогда как обычные клетки на этой среде погибают.

Репортерные гены – кодируют нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях легко обнаружить. В качестве репортерных чаще всего используют гены β-глюкуронидазы (uidA, другое название - gus), зеленого флуоресцентного белка (gfp), люциферазы (luc), хлорамфениколацетилтрансферазы (cat.

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 287; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 4 567 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!