Тест «Стерильность». Метод мембранной фильтрации
Стерильность
Испытание на стерильность выполняют в асептических условиях. Меры предосторожности против контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, обнаруживаемых в ходе испытания. Рабочие условия, в которых выполняется испытание, регулярно контролируются путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны и проведением соответствующих контрольных испытаний.
Для исследований стерильности используют питательные среды. Жидкая тиогликолевая среда предназначена для культивирования анаэробных бактерий, а также пригодна для обнаружения и аэробных бактерий (Нагревают на водяной бане перед использованием и инкубируют при температуре от 30 до 35ºС в анаэробных условиях). Среда на основе гидролизатов соевых бобов и казеина(Инкубируют при температуре от 20 до 25 ºС), и среда Сабуро(Инкубируют при температуре от 20 до 25 ºС) подходит для культивирования как грибов, так и аэробных бактерий.
Среды проверят на ростовые свойства для аэробов, анаэробов и грибов. Используют стандартные штаммы микроорганизмов. Выращивают в определенных температурных условиях не более 3 (для бактерий) и 5 (для грибов) дней. Среды являются пригодными при условии наличия четкого визуально наблюдаемого роста микроорганизмов.
Сами среды проверяют на стерильность путем культивирования в течение 14 дней. Роста микроорганизмов не должно быть.
Для проверки стерильности используют методы мембранной фильтрации и прямой инокуляции.
|
|
|
Метод мембранной фильтрации используется для водных, спиртовых или масляных образцов, а также для агентов, не обладающих антимикробным действием. Используют мембранные фильтры с номинальным размером пор, не превышающим 0,45 мкм. Например, фильтры на основе нитрата целлюлозы используют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов, а фильтры на основе ацетата целлюлозы, в частности, для растворов с высоким содержанием спирта.
Аппарат для фильтрации и мембрану стерилизуют подходящим способом. Конструкция аппарата должна обеспечивать введение и фильтрацию испытуемого раствора в асептических условиях.
Масла и масляные растворы, обладающие достаточно низкой вязкостью, могут быть подвергнуты фильтрованию через сухую мембрану без разбавления. Вязкие масла могут быть при необходимости разбавлены подходящим стерильным растворителем, для которого показано отсутствие антимикробной активности в условиях испытания, например, изопропилмиристатом. Дают маслу проникнуть в мембрану под действием собственной тяжести, затем фильтруют, постепенно увеличивая давление или вакуум. Мембрану промывают растворителем с эмульгатором (например, полисорбат 80).
|
|
|
Мази на жирной основе и водно-масляные эмульсии могут быть разбавлены до содержания 1% изопропилмиристатом при нагревании до температуры, не превышающей 40 ºС. В исключительных случаях может оказаться необходимым нагревание до температуры, не превышающей 44 ºС.
Каллусные и суспензионные культуры растений. Клональное микроразмножение.
Каллусная ткань – это недифференцированная ткань, образованная паренхимными клетками в результате их повреждения и последующих дедифференцировки и деления. Образование и рост каллуса регулируется стимуляторами роста (ауксинами и цитокининами).
Каллусные культуры различаются по интенсивности роста, по консистенции, окраске, способности зеленеть на свету и другим свойствам. Клеточные колонии на агаризованной среде могут быть компактными, твердыми, а также рыхлыми.
Технология получения каллуса. Выбранный эксплантант, представляющий вырезанные маленькие кусочки (2 – 4 мм) растительной ткани, которые находятся в подходящем биологическом состоянии, что необходимо для получения каллусных культур. Этот растительный материал тщательно моют, стерилизуют гипохлоридом натрия, 96% спиртом или 0,1% раствором ртути (II) хлорида, затем тщательно промывают водой очищенной и помещают на синтетическую агаризованную питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами. Работают в боксах. Для образования каллуса и роста ткани сосуды переносят в темное помещение, где строго поддерживают определенный режим. Это касается температуры и влажности. Известно, что для большинства культур эти параметры таковы: температура 24–26°С, а влажность 65–70%. Через 2-3 недели на раневой поверхности образуется первичный каллус.
|
|
|
Культура клеточных суспензий. Растительные суспензионные культуры состоят из одиночных клеток и клеточных агрегатов, растущих в аэрируемой жидкой питательной среде определенного состава.
Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ: легче и более эффективно влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Этот способ более удобен при проведении биохимических и молекулярно-биологических экспериментов.
Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензию перемешивают в колбах на качалке или в специальных сосудах с помощью роллеров разного типа. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2–3 г сырой массы каллусной ткани на 60–100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию получают на качалках, имеющих скорость перемешивания 60–120 об/мин.
|
|
|
Суспензионную культуру можно получить и из фрагмента органа растения, однако этот путь более трудоемкий и требует большего времени.
Рост культуры клеток и тканей характеризуется S-образной кривой.
Различают следующие фазы ростового цикла:
Латентная фаза (лаг-фаза). В этот период клетки не размножаются, отсутствует их видимый рост, но происходит активный процесс поглощения воды и питательных веществ. Идут процессы адаптации.
Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. Это ограниченный период в ростовом цикле периодической (накопительной) культуры, в ходе которого происходит экспоненциальное (логарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления, и как следствие – увеличение сухого вещества.
Линейная фаза очень короткая. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянная.
Фаза замедления роста (ранняя стационарная фаза). В этот период средний размер клеток продолжает возрастать, отмечается гетерогенность клеточной популяции и начало синтеза вторичных веществ.
Стационарная фаза. К этому периоду ростового цикла суспензионная культура достигает максимума сухого веса. В культуральной среде накапливаются продукты жизнедеятельности клеток, угнетающие рост культуры. Культуральная среда истощается по наличию основных компонентов, обеспечивающих азотное, фосфорное, углеводное питание. С тем чтобы не наступила гибель клеток, необходимо субкультивирование суспензионной культуры на свежую среду.
Клональноемикроразмножение и его практическое применение
Культура органов растений (микроклональное размножение) используется для массового размножения растений, оздоровления посадочного материала, получения элитного и суперэлитного посадочного материала, в т.ч. новых сортов лекарственных растений. Важное условие – идентичность полученного растительного материала исходному растению. Для этого берут молодые, слабо дифференцированные ткани. При этом данные части практически лишены вирусов. Что позволяет получить безвирусные клоны.
Пути микроклонального размножения:
1.Прямая регенерация – получение растений «в пробирке» непосредственно из верхушечных побегов или пазушных почек.
2.Косвенная регенерация – получение целых растений из меристематических тканей, но с промежуточной стадией каллуса. Выросшее растение переносят в грунт.
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа:
1.)выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;
2.)собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества клонов;
3.)укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2°, 10ºC);
4.)выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.
Методы клонального размножения растений:
1. Активация пазушных меристем.
2. Образование адвентивных (придаточных) побегов тканями экспланта.
3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.
4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.
5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.
6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 650; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!