Лабораторная работа 2. Определение концентрации глюкозы глюкозооксидазным методом

⇐ ПредыдущаяСтр 19 из 52Следующая ⇒

В крови из веществ углеводной природы в наибольшем количестве содержится глюкоза, поэтому для диагностики нарушений углеводного обмена в клинической практике часто используется определение количества глюкозы в крови.

Принцип метода. Реакция основана на способности глюкозы окисляться в присутствии глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4). Глюкозооксидаза относится к флавопротеинам, специфически катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород воздуха.

В начале ферментативной реакции образуется 6-глюконолактон, который, присоединяя воду, спонтанно превращается в глюконовую кислоту.

Глюкоза + Н₂О + О₂→ Глюконовая кислота + Н₂О₂

При этом образуется в эквимолярных количествах пероксид водорода, который в присутствии пероксидазы (КФ 1.11.1.7) и восстановительных эквивалентов восстанавливается до воды. Добавление в систему красителя (например, ортотолуидина), который приобретает окраску при окислении, или соединений, которые в присутствии пероксида водорода реагируют с образованием окрашенных продуктов (например, фенол и 4-аминофеназон в присутствии Н₂О₂ образуют хинонимин красно-фиолетового цвета), позволяет зафиксировать количество образовавшегося Н₂О₂ колориметрически.

Материалы и реактивы:

1) Энзимы – пероксидаза (2200±220) U/л, глюкозооксидаза (18000±1800) U/л, 4-аминофеназон (110±11) мг/л, стабилизаторы, активаторы;

2) Буферный раствор – фосфатный буфер (рН 7,2-7,4) (0,1±0,01) моль/л, фенол (190±19) мг/л, стабилизаторы;

3) Калибровочный раствор глюкозы (10±0,5) ммоль/л или (1802±90) мг/л;

4) Антикоагулянт – раствор цитрата натрия и хлористого натрия.

Отмерить в пробирку мл	Калибровочная проба	Опытная проба	Холостая проба
Калибровочный раствор Анализируемый р-р Физиологический р-р Буферный раствор Энзимы	0,04 – – 2,00 2,00	– 0,04 – 2,00 2,00	– – 0,04 2,00 2,00
Общий объем в пробирке, мл	4,04	4,04	4,04

Ход работы. Добавить реактивы согласно таблице, выдержать 20 мин при комнатной температуре (+18–25 °С), или 12 мин при температуре +37 °С. Измерить поглощение Е калибровочной и опытной пробы против холостой при 500-546 нм в кювете с длиной оптического пути 10 или 5 мм.

Расчет: С = С _калиб ´ Е _Опыт / Е _калибр _.,

где С _калибр – концентрация калибровочного раствора глюкозы (10 ммоль/л), Е _опыт – поглощение опытной пробы

Е _калибр –поглощение калибровочной пробы

В норме содержание глюкозы в сыворотке, плазме крови составляет (4,22–6,11) мМ или (76–110) г/л, в моче (0–1,11) мМ или (0 – 20) г/л.

Дата добавления: 2016-01-05; просмотров: 28; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 14 15 16 17 181920 21 22 23 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!