Лабораторная работа 8. Исследование сукцинатдегидрогеназы мышц
Сукцинатдегидрогеназа мышц – это железофлавопротеин, катализирующий окисление (дегидрирование) янтарной кислоты в фумаровую. Коферментом сукцинатдегидрогеназы служит флавинадениндинуклеотид (ФАД). Активность фермента зависит от наличия в нем свободных сульфгидрильных групп и атомов железа.
В качестве источника фермента используется отмытая мышечная ткань. Действие этого фермента можно выявить при добавлении к янтарной кислоте метиленового синего или 2,6-дихлорфенолиндофенола, выступающие в качестве акцептора водорода, и, восстанавливаясь, обесцвечиваются.
Конкурентное торможение активности этого фермента вызывает малоновая кислота НООС – СН2 – СООН, являющаяся структурным аналогом янтарной кислоты.
Материалы и реактивы: свежая мышечная ткань, 0,01 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ), 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), 0,1 N раствор едкого натрия, 3 % раствор малоновой кислоты.
Ход работы. Свежую мышечную ткань (1 г) измельчить ножницами и растереть в ступке с небольшим количеством воды (2-3 мл) в течение 1 мин. Полученный гомогенат перенести на двойной слой марли, размещенной на воронке, промыть водой, высушить на фильтровальной бумагу и высушить.
В три пробирки налить по 3 мл фосфатного буфера и поместить в них по 0,1 г мышечного гомогената. Затем в опытную пробирку добавить 5 капель 3 % раствора янтарной кислоты и, для нейтрализации, 5 капель 0,1 N раствора едкого натрия, а в контрольную – 10 капель дистиллированной воды. В третью пробирку добавить 5 капель 3 % раствора малоновой кислоты, 5 капель 3 % раствора янтарной кислоты и 5 капель 0,1 N раствора едкого натрия. Во все пробирки добавить по 1 мл 0,001 н раствора 2,6-ДХФИФ. Хорошо перемешать. Пробы поместить в термостат при 37 0С на 40 мин.
|
|
|
Наблюдается обесцвечивание содержимого в первой пробирке. Сравнить ее с контролем и пробиркой, в которой находился конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы – малоновая кислота. Время обесцвечивания 2,6- ДХФИФ при наличии янтарной кислоты характеризует активность сукцинатдегидрогеназы.
Дата добавления: 2016-01-05; просмотров: 69; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!