Лабораторная работа 5. Свойства ферментов

⇐ ПредыдущаяСтр 12 из 52Следующая ⇒

Свойства ферментов удобно изучать на примере амилазы слюны. Амилаза (a-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1) осуществляет гидролиз крахмала или гликогена через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы. Мальтоза далее под влиянием фермента мальтазы слюны расщепляется на две молекулы глюкозы.

Следить за ходом гидролиза можно с помощью окрашивания реакционной смеси реактивом Люголя (раствор йода в водном йодистом калии). Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают разную окраску йодом. амило-декстрины – сине-фиолетовое, эритродекстрины – красное окрашивание, ахродекстрины и мальтоза окрашивания с йодом не дают (желтоватая окраска обусловлена цветом самого реактива Люголя). Конечными продуктами гидролиза крахмала под действием a-амилазы являются низкомолекулярные декстрины и мальтоза. Об их присутствии судят по реакции Фелинга.

Фракция продуктов гидролиза крахмала	Окраска раствора при добавлении раствора Люголя
Крахмал	Синий, мутный
Амилодекстрины	Сине-фиолетовый, прозрачный
Эритродекстрины	Красный
Ахродекстрины и мальтоза	Бледно-желтый

В качестве источника амилазы в работах 1-3 использовать слюну, разведенную в 4-5 раз.

Работа 1. Влияние температуры на активность ферментов

Скорость ферментативных реакций, как и любых других химических реакций, зависит от температуры: при повышении температуры на 10^оС скорость увеличивается приблизительно в 2 раза. Однако для ферментативной реакции это правило выполняется только в области низких температур – до 50-60^оС. При более высоких температурах происходит денатурация фермента, а следовательно, он терцет каталитическую активность.

Ход работы. В 3 пробирки (№1-3) внести по 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала (субстрат). В другие 3 пробирки (№4-6) внести по 10 капель разведенной слюны (источник фермента). В течение 5 мин пробирки №1 и №4 инкубировать во льду, пробирки №2 и №5 – в термостате при 37⁰С, а пробирки №3 и №6 – в кипящей водяной бане. Затем содержимое пробирок 1 и 4, 2 и 5, 3 и 6 слить вместе (пробирки с субстратом и источником фермента), тщательно перемешать и оставить при тех же температурных условиях на 10-15 мин. Далее при комнатной температуре добавить 3-5 капель реактива Люголя, сравнить окраску и занести результаты в таблицу:

Пробирки	№1 и №4	№2 и №5	№3 и №6
Температура	0^оС	37^оС	100^оС
Окраска с реактивом Люголя

Сделать вывод об оптимальной температуре для работы амилазы.

Работа 2. Влияние рН среды на активность ферментов

Каждый фермент проявляют максимальную активность при определенном значении рН. Это значение называется оптимальным рН. Оптимум рН для большинства ферментов лежит в пределах от 6 до 8, однако есть ферменты с оптимумами рН гораздо ниже 6 (пепсин, рН опт =1,9) и выше 8 (аргиназа, рН опт =9,7). Ниже и выше оптимального значения рН наблюдается снижение активности ферментов. В определённом диапазоне рН процесс обратим. Зависимость активности фермента от рН обусловлена влиянием изменения концентрации ионов водорода на степень ионизации ионогенных групп фермента и субстрата. При экстремальных значениях рН происходит кислотная или щелочная денатурация фермента, следовательно он необратимо теряет активность.

Ход работы. В 4 пробирки налить по 1 мл буферных растворов с различными значениями рН (согласно таблице).

№ пробирки	рН буферного раствора	Окраска при добавлении Реактива Люголя
	5,0
	6,9
	7,5
	8,2

В каждую пробирку добавить по 5 капель 0,5% раствора крахмала и по одной капле разведенной слюны. Перемешать, поместить в термостат (+37°) на 6-7 мин. затем пробирки вынуть из термостата и в каждую добавить по капле реактива Люголя. Сравнить окраску растворов. Результаты занести в таблицу. Сделать вывод о том, при каком значении рН гидролиз крахмала амилазой идет с наибольшей скоростью.

Работа 3. Специфичность действия ферментов

Специфичность действия является одним из важнейших свойств ферментов и заключается в том, что каждый фермент катализирует превращение одного субстрата или группы близких субстратов и одного вида или группы близких химических связей. Специфичность ферментов может быть абсолютной и относительной. Ферменты с абсолютной специфичностью (уреаза, сукцинатдегидрогеназа) катализируют превращение только одного субстрата, а с относительной специфичностью (фосфатазы, протеиназы) – однотипные превращения сходных по строению веществ.

Амилаза расщепляет полисахариды и не действует на дисахариды (мальтозу, лактозу или сахарозу).

Ход работы. В одну пробирку налить 1 мл 0,5% раствора крахмала, а в другую - 1 мл 0,5% раствора сахарозы. В обе пробирки внести по 5 капель разведенной слюны (источник амилазы). Содержимое пробирок перемешать и поместить на 15 мин в термостат (+37°С). Затем в обеих пробирках проводят реакцию Фелинга (добавить равный объем реактива Фелинга и нагреть). Отметить, в какой из пробирок реакция Фелинга положительна. На основании этих результатов делают вывод о характере действия амилазы на данные субстраты.

Лабораторная работа 6. Действие некоторых ферментов (уреаза)

Уреаза (карбамидамидогидролаза, КФ 3.5.1.5) принадлежит к ферментам класса гидролаз, группы амидаз и расщепляет мочевину до двух молекул аммиака и углекислого газа.

В воде СО₂превращается в Н₂СО₃ (слабая кислота), а NH₃ – в (NH₄)OH (сильное основание), в связи с чем изменяется рН среды.

По своему действию уреаза строго специфична — она расщепляет только мочевину, не оказывая влияния на ее производные. Уреаза встречается у очень большого числа растений, плесневых грибов и бактерий. Особенно велико содержание уреазы в бобах сои. У человека она найдена в желудке, где частично нейтрализует HCl желудочного сока за счёт образования (NH₄)OH.

Ход работы. В пробирку налить 2 мл 2% раствора мочевины и добавить около 0,5 г соевой муки, перемешать и добавить 2-3 капли раствора фенолфталеина. В контрольную пробу налить то же количество раствора мочевины и фенолфталеина, но не добавлять соевую муку. Обе пробы оставить при комнатной температуре и проследить за изменением окраски индикатора. Дать пояснения.

Дата добавления: 2016-01-05; просмотров: 149; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 7 8 9 10 111213 14 15 16 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!