Лабораторная работа 7. Количественное определение активности амилазы по Вольгемуту

⇐ ПредыдущаяСтр 13 из 52Следующая ⇒

О наличии фермента в исследуемом гомогенате или экстракте ткани судят либо по снижению концентрации субстрата, на который действует фермент, либо по накоплению продукта реакции. Так, о присутствии амилазы в слюне можно судить по исчезновению крахмала, добавленного к слюне (проба с йодом), или по накоплению глюкозы (проба Фелинга).

Количество фермента можно оценить, измерив величину каталитической активности этого фермента, т.е. скорость реакции, катализируемой этим ферментом. Причем измеряют начальную скорость реакции, когда она линейно зависит от концентрации фермента. Определение активности ферментов проводят в буферных растворах, имеющих значение рН, близкое к оптимальному для данного фермента, при температуре 25—38°С и при концентрации субстрата, близкой к насыщающей. В состав опытных смесей добавляют необходимые коферменты, активаторы и стабилизаторы; последние предотвращают денатурацию ферментного белка.

Согласно международному соглашению за единицу активности U (1U) фермента принимается такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин при 30 °С в оптимальных условиях (рН, концентрация субстрата, кофакторов и др.). Молекулярной активностью называется число молекул субстрата, которое подвергается превращению одной молекулой фермента за 1 мин. Удельная активность выражается числом единиц активности фермента в рассчёте на 1 мг белка (U/мг белка). Другой международной единицей активности фермента является катал (кат) – количество фермента, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в секунду. Употребляются также (особенно в медицине) некоторые тривиальные способы выражения активности ферментов.

Метод опредеделения активности амилазы слюны основан на выявлении предельного разбавления раствора амилазы, при котором в стандартных условиях еще происходит расщепление определенного количества 0,1% раствора крахмала до эритродекстрина. Амилазная активность слюны выражается в количестве (в мл) 0,1% раствора крахмала, которое гидролизуется 1 мл неразбавленной слюны при +38° за 30 мин. В норме амилазная активность слюны А(38^о/30) = 160-320 ед.

Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности в крови и моче.

Материалы и реактивы: 2 мл раствора слюны, разбавленной в 4 раза (к 0,5 мл слюны добавить 1,5 мл дистиллированной воды); 0,1 % раствор крахмала; реактив Люголя (0,1 % раствор иода в 0,2 % растворе иодида калия).

Ход работы. В семь пронумерованных пробирок внести из бюретки по 1мл дистиллированной воды. В 1-ю пробирку добавить 1 мл разбавленной в 4 раза слюны. Содержимое хорошо перемешать и 1 мл полученного раствора перенести из первой пробирки во вторую, из нее — таким же образом в третью и т. д. Из 7-й пробирки 1 мл жидкости вылить. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в 2 раза меньше, чем в предыдущей (разбавление возрастает вдвое). Далее во все пробирки прилить по 2мл 0,1 % раствора крахмала, перемешать и поместить пробирки в термостат (+37°С) на 30 мин. После этого пробирки охладить под проточной водой для прекращения действия фермента. В каждую пробирку добавить по 2-3 капли раствора Люголя, хорошо перемешать и пронаблюдать за изменением окраски. Жидкость в пробирках может окрашиваться в желтый, красный и синий цвета. Желтый цвет свидетельствует о полном расщеплении крахмала. Результаты наблюдений заносят в таблицу.

Показатель	Пробирка
№1	№2	№3	№4	№5	№6	№7
Разбавление слюны (или мочи)
Окраска с реактивом Люголя

Устанавливают минимальное количество слюны, способное расщепить 2 мл крахмала, и рассчитывают количество крахмала, которое расщепляется амилазой, содержащейся в 1 мл слюны. Для этого отмечают пробирку с раствором красноватого оттенка и производят расчет амилазной активности. Пример расчета: В 1,2,3 и 4-й наблюдается слабо-желтое окрашивание, в 5-й пробирке – красно-оранжевое или красно-фиолетовое, в 6-й и 7-й – синее. Для расчета берем пробирку №5, в которой слюна разбавлена в 128 раз. В ней содержится минимальное количество слюны (1/128 мл), способное расщепить 2 мл 0,1% крахмала. Тогда 1 мл слюны расщепляет Х мл 0,1% раствора крахмала. Х=1´2´128 = 256 ед.

Контрольные вопросы по теме ”Ферменты и коферменты”:

1. Ферменты: определение, свойства ферментов как биологических катализаторов.

2. Классификация и номенклатура ферментов, характеристика отдельных классов ферментов.

3. Строение и механизмы действия ферментов. Активный и аллостерический (регуляторный) центры.

4. Кофакторы и коферменты. Строение и свойства коферментов, витамины как предшественники в биосинтезе коферментов.

5. Коферменты: типы реакций, которые катализируют отдельные классы коферментов.

6. Изоферменты, особенности строения и функционирования, значение в диагностике заболеваний.

7. Механизмы действия и кинетика ферментативных реакций: зависимость скорости реакции от концентрации субстрата, рН и температуры.

8. Принципы и методы выявления ферментов в биообъектах. Единицы измерения активности и количества ферментов.

9. Активаторы и ингибиторы ферментов: примеры и механизмы действия.

10. Типы ингибирования ферментов: обратимое (конкурентное, неконкурентное) и необратимое ингибирование.

11. Регуляция ферментативных процессов. Пути и механизмы регуляции: аллостерические ферменты; ковалентная модификация ферментов.

12. Циклические нуклеотиды (цАМФ, цГМФ) как регуляторы ферментативных реакций и биологических функций клетки.

13. Энзимопатии – врожденные (наследственные) нарушения метаболизма углеводов, аминокислот, порфиринов, пуринов.

14. Энзимодиагностика заболеваний.

15. Энзимотерапия – применение ферментов, их активаторов и ингибиторов в лечебных целях.

Дата добавления: 2016-01-05; просмотров: 91; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 8 9 10 11 121314 15 16 17 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!