Черняева М.М., Соловьева И.В., Е.В. Демьяненко
ДИНАМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МОНООКСИДА АЗОТА В КУЛЬТУРЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Научный руководитель д-р мед. наук, проф. Бойченко П. К.
Кафедра медицинской химии
ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЛУГАНСКОЙ НАРОДНОЙ ЕСПУБЛИКИ «ЛУГАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ СВЯТИТЕЛЯ ЛУКИ», г. Луганск
Введение.В последнее время при изучении реализации механизмов жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) большое внимание уделяется роли в этих процессах кислородных метаболитов, в частности, активных форм азота.
Среди активных форм азота особый интерес вызывает NO- маленькая липофильная диффундирующая, очень реактивная молекула, синтезируемая из L-аргинина NO-синтазами. Доказано, что монооксид азота в зависимости от концентрации способен оказывать на клетки цитотоксическое действие, ингибировать эндогенные защитные системы организма, выступать промотором апоптоза в одних клетках и ингибитором в других. Изучение связи между динамическими изменениями содержания NO и способности к пролиферации, дифференцировки стволовых клеток, поддержанию их жизнеспособности при смене условий микроокружения, развитием некоторых патологических состояний является целесообразным.
Особое внимание уделяется изучению ишемических поражений внутренних органов, в том числе и почек, парехима которых, вследствие высокой метаболической активности, крайне восприимчива к любым повреждениям приводящих к острому повреждению почек (ОПП).
|
|
|
Целью исследования было изучение динамики изменений содержания монооксида азота в культуре мезенхимальных стволовых клеток в зависимости от различных условий культивирования
Материалы и методы исследования. В ходе исследования для получения клеточной культуры извлекали клетки красного костного мозга путём промывания питательной средой полостей бедренных костей здоровых взрослых лабораторных крыс. Клетки культивировали 14 суток в питательной среде «Игла МЭМ» («Биолот», Россия) с добавлением 5% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота в условиях СО2-инкубатора со сменой ½ питательной среды каждые 5 дней. Жизнеспособность клеток в культуре оценивали тестом с трипановым синим. Клеточные культуры фенотипировали методом непрямой флюоресценции с помощью маркеров к МСК. Было выделено 2 исследуемые группы: контрольную, в которой клеточную культуру выращивали в стандартных условиях, и экспериментальную, в которой клетки культивировали на питательной среде с добавлением гомогената почечной ткани крыс, перенесших экспериментальную острую почечную недостаточность. Острую почечную недостаточность воспроизводили на самцах беспородных белых крыс возрастом 3 – 4 месяца с использованием модели ишемия/реперфузия. Животных оперировали под тиопенталовым наркозом, с двусторонним пережатием почечных ножек на 30 минут. Забор почек проводился на 3 сутки после операции в стерильных условиях. На 3, 7, 14 сутки культивирования в культурах МСК контрольной и экспериментальных групп определяли концентрации нитритов методом Грисса. Для определения нитратов проводили их предварительное восстановление цинковой пылью. Показатели определяли с с использованием спектрофотометра СФ-46 при длине волны λ=540. Контролем служил дистиллят. Результат рассчитывали по кривой с использованием стандартных растворов нитрита натрия и нитрата калия. Статистическую обработку данных проводили пакетом программ «Statistica 10.0» по критерию Стьюдента. Результаты расценивались как достоверные при р<0,05.
|
|
|
Результаты исследования и их обсуждение. Анализируя Анализируя результаты исследования мы определили временную зависимость динамики изменений продукции нитрит и нитрат-анионов в контрольной и экспериментальной группе, культивируемой в апоптоз индуцированном окружении.
|
|
|
Содержание NO2 и NO3 в контрольной группе на 7 сутки культивирования уменьшилось по сравнению с 3 сутками на 24% и на 4% соответственно. На 14 сутки концентрация веществ увеличилась на 34% и на 4% по сравнению с 3 сутками и на 12,5 % / 9,9% по сравнению с 7 сутками культивирования, так как вследствие постепенного нарастания в клеточной культуре гипоксических условий, происходит стимулирование активности NO- синтаз и увеличение содержания NO2. Так же отмечалось повышение продукции свободных метаболитов оксида азота в культуре клеток, выращенных в условии апоптоз-индцированного окружения во все сроки культивирования по сравнению с группой контроля.
Концентрация нитрит-иона в экспериментальной группе возросла на 3сутки в 2,3 раза, на 7 сутки в 3,3 раза, на 14 сутки в 1,7 раз относительно контроля. Уровень нитрат-аниона в экспериментальной группе на 3 сутки культивирования достоверно увеличился в 2 раза, на 7 сутки – в 2,2 раза, на 14 сутки – в 1,7 раза по сравнению с контрольными значениями. Данная картина может свидетельствовать об активации процессов гипоксии в клеточных культурах, которые культивировались в среде с добавлением активно апоптозирующих клеток почечной ткани после острой почечной недостаточности, и запуске процессов запрограммированной гибели в мезенхимальных стволовых клетках, выращиваемых в среде с проапоптотическими агентами.
|
|
|
Выводы.
1.Процессы гипоксии в культуре мезинхимальных стволовых клеток усиливаются вследствие увеличения сроков культивирования.
2. Продукция метаболитов оксида азота увеличивается со временем культивирования.
3. Добавление фрагментов активно апоптозирующих клеток в среду для культивирования ведет к увеличению уровня нитрит- и нитрат-анионов по сравнению с группой контроля.
УДК 616.127-005.8+616.342-002.44]-079.4
Дата добавления: 2019-08-30; просмотров: 157; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!