ТП 5. Одержання рекомбінантних білків-антигенів

ТП 5.1Лізис біомаси

Наважку біомаси отриману з ТП 4.5 поміщають у мірну склянку, розморожують при кімнатній температурі і ретельно ресуспендують з розчином для промивання клітин. Суспензію отриману розливають у центрифужні склянки (чисті) 250 мл, врівноважують і центрифугують у режимі 11000об/хв. 20 хв., надосадову рідину направляють на ЗВ 9.

У металеву склянку з клітинами додають 4 мл лізоциму, перемішують 2 хв., інкубують 60 хв. Отриманий лізат направляють на ТП5.2

ТП. 5.2, 5.3 Заморожування - розморожування суспензії

З метою більш повного руйнування клітин лізовану біомасу двічі заморожують у холодильнику і відтаюють у водяній бані. Замороження проводиться при -18˚С. Суспензію направляють на ТП 5.4

ТП. 5.4 Обробка ДНК-азою

Після другого розморожування у металеву склянку з лізованою біомасою додають MgSO₄ у розведенні 1:100, перемішують, додають розчин ДНК-ази у розведенні 1:400, перемішують, інкубують при кімнатній температурі до втрати в’язкості. Отриманий розчин направляють на ТП5.5

ТП. 5.5 Відмивання тілець-включення

Озвучену біомасу центрифугують у центрифузі, супернатант направляють на ЗВ9.

До осаду додаємо 60мл розчину для промивання тілець-включення, і вміст склянок гомогенізують у гомогенізаторі до одержання однорідної суспензії. У ній не повинні спостерігатися агрегати при візуальному контролю рідини.

ТП. 5.6 Хроматографічна очистка білків-антигенів

Суспензію. центрифугують. Супернатант направляють на ЗВ9.

Центрифугат розчиняють в 100 мл розчину для розчинення тілець-включення.

Розчин тілець-включення центрифугують при 11000 об/хв. при температурі 4˚С. Осад направляють на ЗВ9. Супернатант спрямовують далі.

До супернатанту на магнітній мішалці порціями додають (NH₄)₂SO₄. Кожну порцію солі додають тільки після розчинення попередньої. Ємність із суспензією залишають на 3 години при 4˚С.

Суспензію розливають у центрифужні склянки (чисті) і центрифугують при 11000 об/хв. при температурі 4˚С. Супернатант направляють на ЗВ9.

До осаду білка додають 20-30 мл очищеної води з ДР1.8, ресуспендують, потім доводять об’єм очищеною водою до 200 мл і повторно ресуспендують.

Суспензію центрифугують у центрифугі, супернатант направляють на ЗВ9. Осад з розчиняють у розчині для розчинення тілець включення (з гуанидин-HCl у фосфатному буфері).

Наносимо матеріал на колонку зі швидкістю 40 мл/год, регістрацію поглинання вихідного із колонки матеріалу роблять за допомогою поточного спектрофотометру, довжина хвилі 280 нм. Після нанесення всього матеріалу колонку промивають розчином для врівноваження. Елюцію білка, що зв’язався промивають розчином буферу для елюції, розчин елюата центрифугують 20 хв. при швидкості 11000 об/хв.

ТП. 6 Одержання компонентів тест – системи

ТП. 6.1 Одержання імуносорбенту

ТП. 6.1.1Приготування розчинів для одержання імуносорбенту

ТП. 6.1.1.1 Приготування робочого розчину антигенів

З робочого розчину карбонатного буферу відбирають 200-300 мл. Додають антиген до кінцевих концентрацій 5 мкг/мл .

ТП. 6.1.1.2. Приготування розчину РЗ ¼ для забивання активних зон імуносорбентів

Склад:

Компонент	Вага
Сухе молоко	10.5 г
Na₂HPO₄ *12 H₂O	6.4 г
NaH₂PO₄*2 H₂O	1.6 г
Сахароза	40г
Вода очищена	до 1 л

Готують розчин Na₂HPO₄*12 H₂O + молоко +H₂O в скляній ємності, а потім центрифугують у центрифугі Ф48 при 3000 об/хв. протягом 40 хв. Супернатант, що містить розчин білка направляють на ЗВ9. Готують ще один розчин (H₂O + Na₂HPO₄*12H₂O,NaHPO₄*2H₂O + сахароза). Потім розчини зливають один в інший, доводять рН до 7.2 розчином НСl і беруть проби розчину Р3 ¼ і направляють на контроль.

ТП. 6.1.2 Приготування та пакування імуносорбенту

ТП. 6.1.2.1. Сорбція антигенів в лунки планшетів

Розчин антигенів з ТП 6.1.1.1 заливають в ємність для розливу і за допомогою автоматичного пристрою розливають в лунки планшетів по 100 мкл. Попередньо встановлюють дозу розливу за водою. Планшети направляють на ТП6.1.2.3.

ТП. 6.1.2.2. Розлив розчину Р31/4

Розчин антигенів вимивають вошером з лунок планшетів в окрему ємність. Розчин РЗ ¼ за допомогою вошера розливають в лунки планшетів. Витримують планшети 30хв., при температурі 25⁰С. час між вимиванням та забиванням для кожного планшету не повинен перевищувати 15хв.

ТП. 6.1.2.3. Сушка планшетів

Розчин антигенів з лунок планшетів які надходять з ТП 6.1.2.3 вимивають в окрему ємність. Планшети висушують на сушильному конвеєрі при температурі 38⁰С візуально проводять контроль наявності залишків вологи.

Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 241; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 17 18 19 20 21 222324 25 26 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!