ТП. 4 Культивування рекомбінантних штамів продуцентів.
ТП. 4.1 Відтворення музейних культур.
Для зберігання та відтворення музейних культур використовують очищену воду з ДР1.8., посуд з ДР1.9., поживне середовище з ДР2
Музей штамів-продуцентів зберігається і підтримується трьома способами.
1-й спосіб (короткочасне зберігання).
Музейні культури штамів – продуцентів для обмеженого терміну збереження (до 1-го року) зберігають у напіврідкому агаризованому ПС№4 (0.75%агару) при температурі 40С.
2-й спосіб
Для довгострокового збереження (до 3-х років) музейні культури і виробничі штами витримують у замороженому стані при -700С.
3-й спосіб
Генетична інформація кожного штаму – продуценту зберігається у виді очищеної плазмідної ДНК у замороженому стані при температурі -700С.
ТП 4.2 Скринінг клонів
Для скринінгу клонів використовують очищену воду з ДР1.8, посуд з ДР1.9., поживне середовище з ДР2.
Скринінг клонів здійснюється за наступним алгоритмом:
- музейну культуру висівають секторами на чашку Петрі та інкубують при температурі 320С протягом 24 годин.
- з вирощеного газону петлею відбирають 10 ізольованих колоній, переносять у стерильні пробірки (3 мл стерильної рідкої ПС) кожну колонію інокулюють в окрему колбу , потім інкубують при 320С 15-16 годин.
- отримані культури клонів перевіряють на продуктивність
відібрані клони направляють в ТП 4.3,
ТП 4.3 Одержання посівного матеріалу
Використана культура застосовується для отримання первинної маточної культури яка у свою чергу використовується для одержання вторинної маточної культури. Вторинна маточна культура застосовується для інфікування поживного середовища при промисловому культивуванні. Сигналом для переходу до наступного етапу культивування є збільшення густини, для вторинної маточної культури вона становить ОГ450=0.7-0.8, а для широкомасштабного культивування ОГ600=0.95-1.00. Контроль оптичної густини дозволяє проводити культивування в логарифмічній фазі росту. Після широкомасштабного культивування проводять фазу термошока, при якій температуру збільшують до 400С. При цій температурі в клітці активується синтез цільового білка антигена. Утворення тілець включення аналізують за допомогою мікроскопу. Сигналом припинення культивування є припинення в збільшенні тілець включення.
|
|
|
Для одержання посівного матеріалу використовують очищену воду з ДР1.8, посуд з ДР1.9, поживне середовище з ДР2.
Заморожену при -700С аліквоту штамів продуцентів розморожують при кімнатній температурі та в розведенні 1:50 вносять в пробірки, що містять 5 мл стерильного ПС№1. Культуру інкубують при температурі 32 0С до ОГ590- (0.85-0.9000) (КП 22) (експоненціальна фаза росту) протягом 6-7 годин. Проводять мікробіологічний контроль, визначають фізіолого-морфологічний стан культури мікроскопічним способом та генетичні особливості штаму. Одержаний посівний матеріал направляють для виробничого культивування.
|
|
|
ТП 4.4 Виробниче культивування штамів-продуцентів.
Для виробничого культивування штамів-продуцентів використовують очищену воду з ДР1.8, посуд з ДР1.9, поживне середовище з ДР2
Складається з етапів:
- одержання вторинної маточної культури
У колбу з сифоном (10л) додають 5л ПС, первинну бульйонну культуру (5мл) з ТП3.3 після чого все закривають і направляють у термостат (температура 32˚С, 12-14 год.). Через 10-12 год. відбирають пробу (3мл) для визначення ОГ культуральної рідини, ОГ450 = 0,7-0,800, після досягнення цього рівня культивування зупиняють. Проводять мікробіологічний контроль.
- широкомасштабне культивування
У стерильний ферментер додають підігріте середовище з ДР2 термостатують при температурі 32˚С, 3 год. Вторинна маточна культура заливаеться у ферментер з ПС та проводять вирощування культури в ферментері при температурі 32˚С. Через кожну годину проводять відбір проб, ОГ600 = 0,95-1,00.
- фаза термошока.
Збільшують температуру культивування до 42˚С. Проводять контроль утворення тілець включення. Отриману біомасу направляють на ТП 4.5
ТП 4.5 Збір біомаси
Біомасу з ТП 4.4 центрифугують в центрифузі. Супернатант направляють на ЗВ 9, а біомасу зважують на терезах та заморожують в холодильнику звідкіля направляють на ТП 5.
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 240; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!