Вибір основних технологічних стадій та операцій
Приготування посуду
Посуд використовується на всіх стадіях та операціях, тому необхідно постійно інтенсифікувати якість посуду, що надасть можливість створювати більш якісну продукцію. Для миття дуже забрудненого посуду використовують реактив Джонса, який заснован на сильних окислювальних властивостях H2Cr2O7. Для підготовки посуду кваліфікації «ч» використовується розчин «Brillo». Для видалення забруднень з середини пробірки використовують глибоку високо інтенсивну обробку йоржиком з середини. Для видалення контамінацій з пробірки проводять 12-кратну обробку теплою водою, та 3-х разове ополіскування очищеною водою. Для видалення води використовують сушіння при 140-1800С. При підготовці посуду до мікробіологічних робіт, замість сушки проводять автоклавування при 160-2000С.
Приготування стерильних поживних середовищ
Ми проводимо приготування стерильних поживних середовищ окремо і спочатку готуємо розчини, які містять вуглеводи та стерилізуємо їх, потім розчини, які містять білки та теж їх стерилізуємо це обумовлено тим, що білки та вуглеводи при стерилізації можуть взаємодіяти. Після чого проводиться контроль на мікробіологічну чистоту.
Підготовка первинної упаковки
Флакони, що використовуються для наповнення розчинами, виготовлені з пластику, що має властивасті набувати електричного заряду. Тому по законам електростатичної взаємодії до флаконів будуть притягуватися мікрочастинки пилу, які можуть бути джерелами контамінації робочих розчинів.
|
|
|
Отже, перед наповненням флакони потрібно обмити водою.
Культивування штамів продуцентів
Зберігання та відтворення музейних культур
На підприємстві створюється музей рекомбінантних штамів мікроорганізмів. Культури зберігаються в замороженому стані, внаслідок чого, довгий час не втрачають життєздатності. У виробництві тест-систем використовуються рекомбінантні штами E. coli , які є найулюбленішим об’єктом більшості робіт з клонування у генетичної інженерії, оскільки цей організм найбільш детально вивчений на молекулярному рівні, генетично модифіковані таким чином, що клітини синтезують білок, який є аналогом поверхневого антигену мікобактерій туберкульозу. Це зроблено для того, щоб не потрібно було працювати з небезпечними видами мікроорганізмів.
Зберігання та відтворення музейних культур проводиться згідно розроблених методик, які були створені на базі експериментальних даних. Данні методики на сьогоднішній час є аксіомою мікробіологічної промисловості.
Скринінг клонів
Мета проведення скринінгу клонів представляє собою підтримання продуктивності клонів, а також вибір клону для промислового культивування. Необхідність проведення скринінгу клонів обумовлена тим, що при зберіганні музейної культури проходить її диспропорціювання. Тобто хоча первісником цієї культури був один штам продуцента, його нащадки після тривалого зберігання володіють різними здібностями до накопичення цільового продукту. Необхідно відмітити, що клони, які несуть екзогенну ДНК мають більш метаболічне навантаження, ніж клони без неї, що призводить до витиснення клонів, які мають здатність синтезувати цільовий продукт. Критерієм селекції клонів є накопичення продуцентом цільового продукту. Вибраний клон буде використовуватись у майбутньому в якості готової посівної культури.
|
|
|
Культивування
Використана культура застосовується для отримання первинної маточної культури яка у свою чергу використовується для одержання вторинної маточної культури. Вторинна маточна культура застосовується для інфікування поживного середовища при промисловому культивуванні (ТП 3.4). Сигналом для переходу до наступного етапу культивування є збільшення густини, для вторинної маточної культури вона становить ОГ450=0.7-0.8, а для широкомасштабного культивування ОГ600=0.95-1.00. Контроль оптичної густини дозволяє проводити культивування в логарифмічній фазі росту. Після широкомасштабного культивування проводять фазу термошока, при якій температуру збільшують до 400С. При цій температурі в клітці активується синтез цільового білка антигена. Утворення тілець включення аналізують за допомогою мікроскопу. Сигналом припинення культивування є припинення в збільшенні тілець включення.
|
|
|
Для виділення біомаси проводять центрифугування. Цей спосіб є найбільш простим, тому ми його і використовуємо.
Одержання рекомбінантних білків-антигенів
Так як тільця включення накопичуються ендогенно, нам необхідно зруйнувати клітинну стінку та ЦПМ. Найбільших зусиль потребує руйнування клітинної стінки. Руйнування клітинної стінки та ЦПМ потребує багато стадій. На 1-й стадії проводять ресуспендування біомаси, використовуючи метод в якому біомасу розтирають о стінки пробірки.
Для відділення зруйнованих клітин, а також їх органел (за виключенням тілець включення), проводять відмивку біомаси від КЖ для відділення біомаси від рідини. Проводять центрифугування біомаси.
Для подальшого руйнування клітинної стінки біомасу обробляють лізоцимом.
|
|
|
Далі проводять процес заморожування (-180С) - розморожування суспензії. При заморожуванні в цитоплазмі клітини утворюються кристали льоду, які мають меншу густину ніж вода, що призводить до розриву клітинної стінки. Ефективність процесу заморожування-розморожування суспензії підсилюється тим, що при низькій температурі клітинна стінка має меншу можливість розтягування.
Для гідролізу ДНК та зменшення в’язкості суспензію обробляють розчином ДНК-ази. Для покращення процесу гідролізу ДНК, молекули ДНК стабілізують іонами Мg2+. Для остаточного лізису клітин проводять озвучування біомаси у дезінтеграторі ультразвуком. Після виконування цих операцій ми отримуємо тільця включення з зруйнованою клітинною стінкою, органелами та їх кусками. Для відділення тілець включення від домішок проводять дев'ятикратну промивку. Кожна промивка включає в себе декілька процесів: центрифугування тілець включення, гомогенізація, при центрифугуванні тільця включення зсідають, а домішки залишаються в супернатанті, який направляють на знешкодження,а при гомогенізації отримані тільця включення гомогенізують з розчином для промивки тілець включення у гомогенізаторі.
Найбільш високоякісну очистку білків-антигенів ми можемо провести за допомогою хроматографічної очистки, але суспензію яку отримуємо не може бути направлена на хроматографічну очистку у зв'язку з тим, що суспензія гетерогенна та має велику кількість різноманітних домішок, тому перед хроматографічною очисткою проводяться 8 підпроцесів по очистці тілець включення. Далі використовуємо процес висолювання тілець включення При цьому проходить зсідання молекул які мають властивість зсідати при великих значеннях іонної силі розчину. Для відділення молекул які не осіли проводять центрифугування.Для знищення залишків солі проводиться діаліз, електроосмос, та відмивку тілець включення. Для отримання гомогенного розчину тілець включення проводимо розчинення тілець включення у гуанідин. Отриманий розчин набуває властивостей для проведення хроматографічної очистки. Хроматографічна очистка дає розчин білку антигену найвищої якості. Отриманий розчин антигену може мати різну концентрацію антигенів, а також різну концентрацію домішок, котрі можуть сприяти на реакцію преципітації, нам необхідно протестувати розчин антигену методом постановки ІФА. Виходячи з даних ІФА розраховують у скільки разів необхідно розбавити розчини антигенів для отримання оптимальних значень ОП в ІФА. Отримані розчини антигенів зливають та наносять на планшети.
Для забивки імуносорбента використовують розчин Р3 ¼.
Для проведення тестування працездатності тест-системи, а також проведення колібровки ІФА використовують розчин позитивного та негативного контролів. Дані розчини готовлять на основі крові донорів у.
Імобілізація антигенів на носіях
Для отримання імуноферментного кон’югату проходить необхідно провести спочатку окислення пероксидази хрону, при цьому проходить окислення спиртових груп у альдегідні або кетонні. При синтезі кон’югату альдегідні та кетонні групи пероксидази хрону взаємодіють з аміногрупами антигену з утворенням сполуки R1-N=CH-R2, де R1 – це остаток антигену, R2 – залишок пероксидази хрону. Необхідно відмітити, що є можливість утворення більш складних комплексів в склад котрих можуть входити декілька антигенів і декілька пероксидаз хрону.
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 310; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!