Знакомство с методами прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

⇐ ПредыдущаяСтр 22 из 22

Прямая иммунофлюоресценция. Принцип: на фиксированный препарат наносят меченные флюоресцином антитела к иммуноглобулинам. Учет результатов осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа. Оценивается характер свечения, форма, размер, взаимное расположение объектов.

Полимеразная цепная реакция. ДНК и РНК-анализ в настоящее время является самым современным, быстрым и точным методом диагностики различных инфекционных заболеваний.

В основе всех молекулярно-биологических методов лежит фундаментальное свойство нуклеиновых кислот – комплементарность (взаимное соответствие), т.е. существование их в виде двойной спирали, при которой обе цепи комплементарны друг другу.

Определение нуклеиновых кислот в любой среде позволяет провести прямое обнаружение инфекционного аганта, причем теоретически для этого достаточно всего одной молекулы искомого возбудителя среди миллионов других молекул нуклеиновых кислот.

Таким образом, технологии определения ДНК и РНК относятся к прямым методам диагностики.

ПЦР - анализ клинического образца включает в себя три основных этапа: пробоподготовка, амплификация и регистрация результатов. Взятие клинического материала для проведения ПЦР диагностики является наиболее «уязвимым» местом в ходе постановки реакции, требует обязательное наличие специальных транспортных сред, а также напрямую зависит от квалификации специалиста, выполняющего данную манипуляцию. Объектом исследования может служить любой биоматериал (соскоб клеток цервикального канала, уретры, отделяемое содержимого влагалища, моча, сок предстательной железы и т.д.), взятый от больного и доставленный в ПЦР-лабораторию. В результате несложных манипуляций из полученного биоматериала выделяют нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), являющиеся матрицей для реакции амплификации. Реакция амплификации представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 30-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой специфических праймеров, в количестве, достаточным для его детекции. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле (большинство отечественных тест-систем) либо путем гибридизации со специфическим к последовательности ампликона олигонуклеотидным зондом.

Преимущества ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:

1. Прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов – 10³-10⁵ клеток).

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК или РНК возбудителя. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы.

5. Высокая скорость получения результата анализа (актуальность). Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Используя метод ПЦР, можно получить результат анализа за 4-4.5 часа.

6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении внутриклеточных паразитов и возбудителей с высокой антигенной изменчивостью.

Разновидностью ДНК-диагностики является РНК- диагностика. Так называемая NASBA (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification)

В отличии от обычной ПЦР, мишенью для NASBA служат молекулы РНК рибосом микроорганизмов, что дает целый ряд преимуществ перед ПЦР:

1. Более высокая чувствительность анализа.

Количество рибосом в одной клетке содержится от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч. Для сравнения: даже большие участки ДНК, используемые в качестве мишени для ПЦР, не превышают двух десятков на бактериальную клетку. Тем самым с помощью NASBA можно выявлять возбудителей и в тех случаях, когда их количество слишком мало и недостаточно для выявления методом ПЦР.

2. Выявление только живых микроорганизмов.

В то время как ДНК – достаточно стабильный материал и обнаружение ДНК еще не означает наличие жизнеспособных микроорганизмов, РНК – наоборот крайне нестабильный материал и достаточно быстро деградирует при гибели и разрушении клеток микроорганизмов. Это дает возможность не только более правильно судить о наличии текущей инфекции, но и более точно и надежно оценивать результаты проведенного лечения.

Детекция продуктов амплификации в режиме реального времени (NASBA-Real-time) с использованием флуоресцентных зондов дополнительно увеличивает специфичность теста и объективность результатов лабораторного исследования.

Принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в реальном времени является возможность фиксации накопления продуктов амплификации непосредственно во время её проведения. Так как скорость накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК инфекционных агентов. Полученная информация может быть использована для контроля эффективности проводимой терапии, оценки клинического прогноза.

Основными недостатками метода NASBA – Real - time являются высокая стоимость и сложность исследования, что ограничивает распространение этого метода в практическом здравоохранении. Ввиду этого, метод рекомендован для подтверждения (или исключения) наличия возбудителя в спорных случаях.

1. Более высокая чувствительность анализа.

2. Выявление только живых микроорганизмов.

Рекомендуемая литература

1. Клиническая дерматовенерология. Рук. для врачей. Под ред. Акад. РАМН Ю.К. Скрипкина, проф. Ю.С. Бутова. М., «ГЭОТАР-Медиа» 2009.

Кожные и венерические болезни под ред. Иванова О.Л. М., «Шико» 2002.
П. Альтмайер. Терапевтический справочник по дерматологии и аллергологии. М., «ГЭОТАР-МЕД» 2003.
Н.Н. Полушкина. Диагностический справочник дерматовенеролога. М.: АСТ, 2007.
В.П. Адаскевич, В.М. Козин. Кожные и венерические болезни. М.: «Медицинская литература», 2006.
В.А. Аковбян, Е.В. Соколовский, В.И. Прохоренков. Инфекции, передаваемые половым путем. М.: «Медиа Сфера».
Дерматовенерология (Клинические рекомендации) под ред. А.А. Кубановой. М.: ДЭКС-Пресс, 2008.

Дата добавления: 2018-05-12; просмотров: 949; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 13 14 15 16 17 18 19 20 2122

Мы поможем в написании ваших работ!