ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭНДОГЛЮКАНАЗ СОЛОДА

 

Цель работы:Освоить методику определения активности эндоглюканаз солода.

 

Общие положения

Система целлюлолитических ферментов (целлюлаз) содержит главным образом три типа целлюлолитических ферментов: эндо-1,4-β-глюканазы, экзо-1,4-β-глюканазы и β-глюкозидазы.

Эндо-1,4-β-глюкан-4-глюканогидролазы (КФ 3.2.1.4) неупорядо­ченным способом гидролизуют β-1,4-связи в β-1,4-глюканах.

Экзо-1,4-β-глюкан-4-глюкогидролазы (КФ 3.2.1.74) отщепляю­т глюкозу с невосстанавливающих концов ангидроглюкозных цепей β-глюканов.

Данная система целлюлолитических ферментов расщепляет нативную целлюлозу до глюкозы. Механизм ферментативного расщепления целлюлозы различен в зависимости от типа ферментов.

Эндо-1,4-β-глюканазы характеризуются способностью гидролизовать неупорядоченным образом внутренние связи в β-1,4-глюканах и олигосахаридах, состоящих из остатков β-1,4-D-глюкозы, с образованием сначала олигосахаридов с более короткими цепями, а затем - целлобиозы и глюкозы.

Основная роль эндоглюканаз заключается в быстром снижении вязкости растворов водорастворимого производного целлюлозы - Na-кар-боксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) с образованием небольшого количе­ства восстанавливающих веществ.

Оптимум рН целлюлолитических систем находится в области 4-6. Целлюлолитические системы характеризуются относительной термо­стабильностью, температурный оптимум многих из них при 60° С.

Целлюлоза (клетчатка) является высокомолекулярным полисаха­ридом и представляет собой линейный β-1,4-глюкан (С₆Н₁₀О₅)_n с видо­вой специфичностью степени полимеризации. Ее молекула представляет собой длинную неразветвленную цепь остатков глюкозы, соединенных между собой β-гликозидной связью.

Наиболее распространенным видом целлюлозосодержащего сырья являются отходы различных отраслей промышленности и сельского хозяйства: солома пшеницы, ржи, риса; просяная, овсяная и подсолнечная лузга; отходы деревообрабатывающей и лесной промышленности.

Процесс ферментативного гидролиза этих целлюлозосодержащих материалов протекает с довольно низкой скоростью. Для характеристи­ки действия целлюлолитических ферментов используют субстраты, по­лученные в результате предварительной обработки указанных выше целлюлозосодержащих материалов.

При определении активности эндоглюканазы (С_х-фермента) в каче­стве субстратов чаще всего используют растворимые производные цел­люлозы. Наиболее пригодным из них являет­ся натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) и натриевая соль эфира целлюлозы и гликолевой кислоты. Na-КМЦ может быть по­лучена при действии на целлюлозу в щелочной среде монохлоруксусной кислоты или ее натриевой соли. Степень замещения Na-КМЦ является главным фактором, определяющим ее растворимость.

Важнейшая роль в поли­ферментной системе принадлежит эндоглюканазам. Роль эндоглюканаз заключается в неупорядоченной деструкции целлюлоз­ных цепей, приводящей к образованию промежуточных целлоолигоса-харидов, которые, в свою очередь, атакуются экзоферментами - целло-биогидролазами и экзоглюканазами. Эндоглюканаза создает субстрат для экзоферментов. Эндоглюканазы характеризуются различной суб­стратной специфичностью по отношению к замещенным производным целлюлозы.

Активность эндоглюканазы определяют:

• по способности осахаривать Na-КМЦ;

• по снижению вязкости растворов Na-КМЦ (вискозиметрические методы);

• по снижению мутности суспензий аморфной целлюлозы (турбиди-метрический метод).

Для определения активности целлюлаз по количеству образовав­шихся углеводов применяют колориметрические, спектрофотометрические и титриметрические и вискозиметрические методы анализа.

За единицу эндоглюканазной активности в данном методе принято такое количество фермента, которое катализирует за 1 ч гидролиз цел­люлозы с образованием 1 мг глюкозы в принятых условиях.

Вискозиметрический метод, основанный на увеличении текучести раствора Na-КМЦ

Метод основан на определении скорости уменьшения вязкости 0,3 %-ного раствора Na-КМЦ после действия целлюлазы. Для приго­товления субстрата используют Na-КМЦ со степенью замещения 65,3% и степенью полимеризации 347 глюкозных единиц.

Эндоглюканазную активность определяют по способности снижать вязкость раствора Na-КМЦ при температуре 28° С с применением вис­козиметра Оствальда.

За единицу эндоглюканазной активности в данном методе принято такое количество фермента, которое в принятых условиях опыта приво­дит к увеличению текучести (величины, обратной относительной вязко­сти), равному 1 мин^{- 1}.

Текучесть

b =  ,                                   (7.9)

где t_e u t₀ - продолжительность истечения воды и реакционной смеси, с.

Скорость возрастания этой величины в единицу времени является линейной функцией концентрации фермента.

 

Аппаратура и реактивы: Вискозиметр; водяная баня; термометр; ацетатный буферный раствор с рН 4,7; субстрат – 0,3 %-ный раствор Na-КМЦ в ацетат­ном буферном растворе; ферментный раствор; дистиллированная вода.

Приготовление ферментного препарата.Взвешивают 5 г измельченного воздушно-сухого солода, или 10 г зеленого солода из расчета на сухое вещество, с точностью до 0,01 г, прибавляют 5 см³ фосфатного буфер­ного раствора и 45 см³ дистиллированной воды. Полученную смесь пе­ремешивают и выдерживают в термостате 30 мин при температуре 30-35 °С, затем раствор фильтруют и фильтрат используют для анализа.

Приготовление субстрата – 0,3 %-ного раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ).0,3 г Na-КМЦ взвешивают с точностью до 0,0001 г и количественно переносят каждую навеску в мерные колбы вместимостью 100 см³. Приливают 50 см³ 0,1 М ацетатного буферного раствора и колбу с содержимым перио­дически погружают в кипящую водяную баню при непрерывном поме­шивании. После полного растворения Na-КМЦ содержимое колб охла­ждают до комнатной температуры, доводят объем до метки тем же аце­татным буферным раствором и перемешивают.

Порядок проведения работы

Перед определением активности фермента устанавливают продолжительность истечения 6 см³ дистиллированной воды. Затем в вискозиметр Оствальда вносят 5 см³ 0,3 %-ного раствора Na-КМЦ в ацетатном буферном растворе с рН 4,7, перемешивают про­дуванием, добавляют 1 см³ испытуемого ферментного раствора и сразу же включают секундомер. Реакционную смесь перемешивают продува­нием и через 2 мин с момента включения секундомера измеряют время истечения. Определение повторяют, добиваясь сходимых результатов.

Активность эндоглюканазы (ед./г) рас­считывают по формуле:

 

ЦА_х = ,                                  

где b - текучесть; 1000 - коэффициент перевода миллиграммов в граммы; а - количество ферментного препарата в реакционной смеси, мг; t - длительность действия фермента на субстрат, мин.

Пример.Определить эндоглюканазную активность ферментного препарата целлокандина Г3х. Готовят ферментный раствор, содержащий 0,1 г препарата в 100 см³ дистиллированной воды. а = = 1 мг пре­парата.

В результате замеров получено, что продолжительность истечения воды составила 10 с, реакционной смеси - 22,5 с.

 

b =                                        ЦА_х = ед./г.

 

Запись в лабораторном журнале производится по следующей форме:

Наименование показателя	1 повторность	2 повторность	Среднее значение
Продолжительность истечения воды, с
Продолжительность истечения реакционной смеси, с
Активность эндоглюканазы, ед/см3

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Механизм ферментативного расщепления целлюлозы цитолитическими ферментами.

2. В чем заключается основная роль эндоглюканаз?

3. Оптимум рН целлюлолитических систем.

4.  Температурный оптимум целлюлолитических систем.

5. Что используется в качестве субстрата для определения эндоглюканазной активности ферментов?

6. На чем основаны методы определения целлюлолитической активности?

Лабораторная работа № 11

Определение СОДЕРЖАНИЯ аминного азота в солоде

(медный способ)

 

Цель работы:Определить степень растворения солода по количеству образовавшегося аминного азота.

 

Общие положения

Все (высокомолекулярные) протеины за ис­ключением небольшого количества выпадают в осадок самое позднее при кипячении сусла. Поэтому в пиво попадают только продукты расщепления, которые, однако, безусловно, не­обходимы для размножения дрожжей и быстрого сбраживания.

Ферментативное расщепление белковых веществ должно рассматриваться дифферен­цированно, так как:

- при 45-50°С в большей степени образуют­ся низкомолекулярные продукты расщепле­ния, особенно пептиды и аминокислоты;

- при 60-70 °С в большей степени образуются высокомолекулярные продукты расщеп­ления, которые считаются обеспечиваю­щими пеностойкость.

Таблица 3 Влияние продуктов расщепления белка на качество пива

Продукты расщепления белка	Положительное влияние	Отрицательное влияние
Высокомолекулярные продукты расщепления	Пенообразователи	Создают помутнения
Низкомолекулярные продукты расщепления	Bкуc (полнота вкуса)	Питание дрожжей

Аминокислоты имеют большое значение для питания дрожжей. Дрожжи потребляют как минимум 10-14 мг α-аминного азота  на 100 мл сусла.

Так как аминокислота пролин как постав­щик α-аминокислоты для дрожжей не используется, то в сусле должно содержаться α-аминного азота  не менее 20 мг/100 мл. Если значения не удастся обеспечить, то это приводит:

- к снижению скорости размножения дрожжей;

- к торможению процессов брожения и со­зревания;

- к сохранению в пиве нежелательных ве­ществ, придающих ему букет молодого пива.

Из хорошо растворенного солода всегда получают сусло, содержащее достаточное ко­личество α-аминокислот.

Метод определения аминного азота основан на способности большинства аминокислот и пептидов образовывать раствори­мые комплексные соединения с медью. Избыток меди оттитровывают, а ее количество, эквивалентное аминному азоту, переводят в соль уксусной кислоты и определяют количественно йодометрическим титрованием.

Аппаратура и реактивы: водяная баня; мерная колба вместимостью 100 см³; бюретка; фильтровальная бумага; раствор хлорида меди; раствор трехзамещенного фосфата нат­рия; боратный буфер­ный раствор; суспензия фосфата меди; раствор тимолфталеина; 0,01 н. раствор тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃ ); 1 н раствор NaOH; 80%-ная (ледяная) уксусная кислота; йодид калия; 1 %-ный раствор крахмала.

Приготовление раствора хлорида меди. 27,3 г хло­рида меди растворяют в 1 дм³ воды.

Приготовление раствора трехзамещенного фосфата нат­рия. 64,5 г двухосновного фосфата натрия растворяют в 500 мл дистиллированной воды, лишенной СО₂, добавляют 7,2 г NaOH и после растворения доливают водой до 1 л.

Приготовление боратного буфер­ного раствора. 57,21 г буры растворяют в 1,5 дм³ воды, добавляют 100 см³ 1 н раствора НС1 и доводят водой до 2 дм³).

Приготовление суспензии фосфата меди. Один объем хлорида меди смешивают с двумя объемами раствора боратного буферного раствора. Суспензию можно использовать в течение 2-3 сут.

Приготовление раствора тимолфталеина. 0,25 г тимолфталеина растворяют в 100 см³ 50 %-ного этило­вого спирта.

Приготовление 0,01 н. раствора  Na₂S₂O₃ . Готовится ежедневно путем разбавления 0,1 н. раствора Na₂S₂O₃ с последующей про­веркой титра по KJO₃.

Приготовление сусла. См. лабораторную работу №3.

Приготовление 1%-ного раствора крахмала. Навеску 1 г растворимого крахмала (в пересчете на сухое вещество) тщательно перемешивают с 99 см³ холодной воды и при непрерывном взбалтывании растворяют на кипящей водяной бане. Раствор кипятят в течение 5 мин, затем охлаждают при непрерывном размешивании, чтобы на поверхно­сти не образовалась пленка.

 

Порядок выполнения работы

В ходе определения 10 см³ сусла помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, прибавляют 3-4 капли тимолфталеина и 1 н раствор гидроксида натрия до получения бледно-голубого окрашива­ния. Осторожно при перемешивании несколькими порциями приливают 30 см³ суспензии фосфата меди, а затем колбу до­водят до метки дистиллированной водой. Смесь тщательно пе­ремешивают и фильтруют через бумажный фильтр, перефильтровывая первые порции фильтрата.

10 см³ совершенно прозрачного фильтрата подкисляют 0,5 см³  80%-ной (ледяной) уксусной кислоты, прибавляют к нему 1 г йодида калия и после размешивания выделившийся свободный йод оттитровывают 0,01 н раствором тиосульфата натрия, до­бавляя под конец титрования 1-2 капли      1 %-ного раствора крахмала. Титрование заканчивается при достижении обесцве­чивания раствора.

Количество пошедшего на титрование тиосульфата натрия, умноженное на 0,28, дает содержание аминного азота в 10 см³ фильтрата, что соответствует 2 см³ сусла с учетом разбавления (исходя из того, что 1 см³ 0,01н раствора тиосульфата соответствует 0,28 г азота).

Количество аминного азота N_а (в мг) в 100 см³ сусла вычисляется по формуле

N_а = а · 0,28 · 5 · 10 ,

 

где а – количество 0,01н раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование выделившегося йода, см³; 5 и 10 – коэффициенты пересчета с 2 см³ на 100 см³.

В 100 г экстракта аминного азота:

 

N₁ = ,

 

где ρ – относительная плотность сусла;

m – массовая доля сухих веществ в сусле,%.

Если солод перерастворен, то в 100 г экстракта будет содержаться более 230 мг аминного азота; если солод очень хорошо растворен – 230…200 мг; если хорошо растворен – 200…180 мг; если плохо растворен – менее 180 мг.

В пересчете на 100 г СВ солода содержание аминного азота варьирует от 120 до 160 мг.

Запись в лабораторном журнале производится по следующей форме:

Наименование показателя	1 повторность	2 повторность	Среднее значение
Влажность солода (W), %
Количество 0,01н раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование выделившегося йода (а), см3
Содержание аминного азота в 100 см3 сусла (Nа), мг
В 100 г экстракта аминного азота (N1), мг

Пример. На титрование лабораторного сусла относительной плотностью 1,0357 (содержание сухих веществ 8,951%) пошло 1,28 см³ тиосульфата. Содержание аминного азота в 100 см³ сусла будет

N_а = 1,28 · 0,28 ·  5 · 10 = 17,92 мг.

В 100 г экстракта аминного азота N₁ = 17,92 · 100 / (1,0357 · 8,951) = 193,3 мг.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Назовите продукты расщепления белковых веществ.

2. Какое влияние они оказывают на вкус и качество пива?

3. Какое значение имеют аминокислоты при приготовлении пива?

4. Как можно регулировать образование тех или иных продуктов расщепления белковых веществ?

Лабораторная работа №12

---

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 1739; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!