Определение активности БЭТТА-амилазы солода ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Цель работы:освоить методику определения активности β-амилазы солода поляриметрически.

Общие положения

β-Амилаза (α-1,4-α-D-глюканмальтогидролаза, сахарогенная амилаза КФ. 3.2.1.2) - осахаривающий фермент экзотипа. Действует с нередуцирующего конца цепи амилозы, амилопектина или гликогена и гид-ролизует вторую с конца α-1,4-связь, образуя β-мальтозу. α-1,6-Гликозидные связи в амилопектине и гликогене фермент не гидролизует, поэтому деградация разветвленных полимеров происходит не полностью. При действии β-амилазы на амилопектин образуется 50-60% мальтозы и β-предельные декстрины, имеющие на конце остаток глюкозы, соединенной α-1,6-связью. Растительные β-амилазы являются сульфгидрильными ферментами и для их активации не требуются ионы металлов. β-Амилаза содержится в зерне пшеницы, ржи, ячменя, сои и других бобовых.

Методы определения активности осахаривающих ферментов основаны на определении скорости ферментативной реакции превращения крахмала в редуцирующие сахара. В процессе этой реакции образуется целый комплекс редуцирующих углеводов, поэтому осахаривающую активность определяют в пересчете на какой-либо один сахар, содержащийся в гидролизате в преобладающем количестве: мальтозу - при анализе солодов; глюкозу - при анализе препаратов, полученных с грибными продуцентами. В связи с этим допускается некоторая погрешность, так как присутствуют различные углеводы. Активность данных материалов будет определяться не только количеством образовавшегося сахара, по которому ведется расчет, но и составом редуцирующих углеводов, который может меняться в зависимости от природы продуцента, способов и условий культивирования микроорганизмов и т. д. Для более объективной характеристики ферментных препаратов предлагается несколько методов определения их осахаривающей активности.

В основу поляриметрического метода положено определение скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала, которая устанавливается по снижению значения угла вращения плоскости поляризации света субстратом - крахмалом - и продуктами его гидролиза.

Поляриметрический метод позволяет определять осахаривающую активность ферментных материалов с достаточной точностью. Погрешность не превышает ±5,0% относительных.

Уменьшение угла вращения плоскости поляризации происходит в результате образования сахаров и низкомолекулярных углеводов, у которых удельный угол вращения плоскости поляризации ниже такового у крахмала. Уменьшение угла вращения плоскости поляризации реакционной среды находится в прямой зависимости от количества образовавшихся из крахмала низкомолекулярных углеводов, количество которых прямо пропорционально количеству фермента, введенного в реакцию (рисунок 1).

За единицу осахаривающей активности (ОС_п) принимают такое количество фермента, которое за 60 мин при 50° С и величине рН, специфичной для него, катализирует распад до низкомолекулярных углеводов 1 г растворимого крахмала, что составляет 10% его количества, введенного в реакцию.

Аппаратура и реактивы: сахариметр СУ-4 или поляриметр; водяная баня; пипетки; пробирки;субстрат — 2 %-ный раствор растворимого крахмала; фосфатный буферный раствор с рН 4,8-4,9; осадители - 30 %-ный раствор сульфата цинка и 15 %-ный раствор гексацианоферрата калия (II); 1 н раствор соляной кислоты.

Рисунок 1. Зависимость изменения угла вращения плоскости поляризации (разность величин поляризации контрольного и опытного растворов) от числа единиц активности осахаривающих ферментов: 1 и 2 – количество препарата и активность; 3 – степень гидролиза субстрата.

Приготовление субстрата - 2 %-го раствора крахмала. Для приготовления 100 см³ субстрата на аналитических весах берут навеску растворимого крахмала 2 г с учетом влажности крахмала. Например, было установлено, что влажность партии растворимого крахмала, используемого для анализа, 12%. Для приготовления 100 см³ субстрата необходимо взять навеску в размере х =100·2/ 88 = 2,272 г, где 88 - содержание сухих веществ в образце, %. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³. Суспензию перемешивают и добавляют около 25 см³ дистиллированной воды. Общее количество добавленной воды вместе с промывными водами должно быть не более 50-60 см³. Суспензию в колбе вновь перемешивают и помещают в кипящую водяную баню, непрерывно помешивая, до полного растворения крахмала. Полученный раствор охлаждают и добавляют 10 см³ буферного раствора фосфатного с рН 4,85.

После добавления буферного раствора объем в колбе доводят до метки дистиллированной водой при 20° С и перемешивают.

Полученным раствором субстрата можно пользоваться в течение 10 дней при условии хранения его на холоде. В этом случае каждый день перед использованием субстрат нагревают в кипящей водяной бане в течение 5-10 мин.

Приготовление фосфатного буфера с рН 4,8-4,9. Готовят из двух растворов: а) 11,876 г гидроортофосфата натрия Na₂HPO₄·2Н₂О в 1 дм³ дистиллированной воды; б) 9,078 г безводного дигидроортофосфата калия КН₂РО₄ в 1 дм³дистиллированной воды. Состав фосфатной смеси: 0,6 частей раствора Nа₂НРО₄ и 99,4 частей раствора КН₂РО₄.

Приготовление ферментной вытяжки. Анализируемый солод измельчают на механической или ручной мельнице, отбирают среднюю пробу и определяют влажность. Навеску 5 г заливают 10 см³ фосфатного буфера с рН 4,8-4,9 и 90 см³дистиллированной воды. Полученную суспензию для полного извлечения фермента выдерживают в течение 60 мин в термостате с температурой 30° С, периодически перемешивая стеклянной палочкой. Затем суспензию фильтруют, и фильтрат используют в качестве основного раствора для определения активности осахаривающих ферментов солода. Для проведения ферментативной реакции используют рабочий раствор, который готовят из основного путем разбавления последнего (таблица 1).

Приготовление 30 %-ного раствора сульфата цинка. 30 г ZnS0₄ высыпают в склянку вместимостью 100 см³ с притертой пробкой, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и приливают до метки дистиллированную воду. Раствор перемешивают и хранят в темном месте.

Приготовление 15 %-ного раствора гексацианоферрата калия (II). 17,65 г K₄Fe(CN)₆ помещают в склянку вместимостью 200 см³ с притертой пробкой и приливают 100 см³ дистиллированной воды. Перемешивают и хранят в темном месте.

Порядок выполнения работы

Проводят ферментативную реакцию при температуре 50° С, рН 4,8-4,9 (фосфатный буфер). Продолжительность реакции 30 мин, объем реакционной среды 30 см³ (20 см³ субстрата и 10 см³ ферментного раствора).

Берут две пробирки для анализа опытного и контрольного растворов. В одну из них наливают 20 см³ субстрата и помещают в ультратермостат или водяную баню с температурой 50±0,2° С. В термостате пробирку с содержимым выдерживают в течение 5-10 мин, чтобы субстрат нагрелся до нужной температуры. Затем к нему добавляют 10 см³ рабочего ферментного раствора, также нагретого до 50° С, перемешивают и выдерживают в термостате 30 мин. По истечении этого срока пробирку с содержимым вынимают, добавляют 1 см³ термостатированного 1 н раствора соляной кислоты для инактивации фермента. Затем для осаждения белков и осветления раствора приливают 1 см³ 30 %-ного раствора сульфата цинка и после перемешивания 1 см³ раствора гексацианоферрата калия (II).

Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в другую пробирку вносят последовательно 10 см³ ферментного раствора, 1 см³ 1 н раствора соляной кислоты, по 1 см³ растворов сульфата цинка и гекса-цианоферрата калия (II) и 20 см³ субстрата. Содержимое пробирок перемешивают и фильтруют. В фильтратах (контрольном и испытуемом) определяют поляризацию на сахариметре СУ-4 в трубке длиной 200 мм. Получают два значения угла вращения: П_к- контрольного раствора и П₀ - исследуемого раствора.

Разность между значением величины угла вращения плоскости поляризации контрольного и исследуемого растворов П_к - П_о = ΔП показывает величину угла поляризации, которая пропорциональна количеству образовавшихся низкомолекулярных углеводов в процессе ферментативной реакции. Значение ΔП не должно быть менее 0,2° при определениях на сахариметре и 0,1° - на поляриметре с круговой шкалой. В противном случае опыт повторяют с другой концентрацией ферментного раствора.

Осахаривающую активность рассчитывают по специальным уравнениям, подставляя в них полученную величину ΔП при анализе солода с применением сахариметра СУ-4:

ОС = ; (1)

где 0,050; 0,0114 - постоянные коэффициенты, полученные экспериментально путем изучения зависимости ΔП от количества введенных единиц фермента в реакционную среду; а - количество солода, содержащихся в реакционной среде, мг.

Запись в лабораторном журнале производится по следующей форме:

Наименование показателя	1 повторность	2 повторность	Среднее значение
Влажность солода, %
ОС солода предполагаемая, ед/г
Поляризация контрольного раствора, П_к
Поляризация опытного раствора, П_о
ΔП
Осахаривающая активность (ОС), ед/г

Пример. Определить осахаривающую активность ячменного солода. Готовят его основной раствор, содержащий 5 г в 100 см³ дистиллированной воды, и разбавляют в 20 раз. а = 5 • 5 • 10 • 1000/100 • 100 = 25 мг. Угол вращения измеряют на сахариметре СУ-4. Поляризация контрольного раствора П_к =15,1, опытного П₀ = 12,6 ° S, ΔП= 15,1 - 12,6 = 2,5° S. Подставляя а и ΔП в уравнение, находят активность исследуемого солода:

ОС = 10³(0,05*2,5 – 0,0114) / 25 = 4,54 ед/г.

Влажность солода 43%, его активность на абсолютно сухое вещество

ОС_с.в. = 4,54*100 / (100-43) = 7,96 ед/г.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. рН -оптимум действия β-амилазы.

2. Температурный оптимум действия β-амилазы.

3. Как дейтвует β-амилаза на субстрат?

4. На чем основаны методы определения активности осахаривающих ферментов?

Лабораторная работа №7

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 1733; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 9 10 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!