ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ СОЛОДА

Цель работы:освоить методику определения активности протеолитических ферментов солода.

Общие положения

Протеиназы гидролизуют непосредственно белок. Из белка образуются полипептиды и свободные аминокислоты. К этой группе протеиназ принадлежат ферменты пепсин, трипсин, химотрипсин, папаин, фицин, ренин и др.

Тиоловые протеиназы (КФ 3.4.22), содержащие в активном центре цистеин, представлены в основном растительными протеиназами. В эту группу входят папаин, бромелаин и фицин.

Принцип действия протеолитических ферментов на субстраты

В процессе действия протеолитических ферментов на субстраты решающую роль, прежде всего, играет структура молекул субстрата, соответствующая часть молекулы субстрата, в которой происходит разрыв пептидной связи.

Характер распада белковых молекул на пептиды и аминокислоты зависит от природы субстрата, фермента и внешних условий. Протеолитические ферменты способны проявлять максимальную активность в определенном интервале рН. По этому признаку они делятся на кислые, слабокислые, нейтральные, слабощелочные и щелочные. Кислые протеиназы проявляют максимальную активность при рН 1,7-3,0, слабокислые - при рН 4,0-6,0, нейтральные - при 6,5-7,5, слабощелочные -при рН 7,5-8,0, щелочные - при рН выше 8,0.

В качестве белковых субстратов наиболее широко используют желатин, казеин, гемоглобин, сывороточный альбумин, кератин, эластин.

Протеолитическая активность характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г твердых или в 100 см³ жидких ферментных материалов.

Для характеристики ферментных препаратов и оценки их качества предлагаются методы, основанные на двух способах определения про-теолитической активности.

В одном из способов протеолитическую активность определяют по скорости ферментативной реакции гидролиза белка (казеина, казеината натрия и гемоглобина), устанавливаемой по общему количеству не осаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктов, которые образуются за определенный промежуток времени; в другом - по количеству образовавшихся тирозина и триптофана. Анализ гидролизатов в первом случае производится интерферометрическим методом, во втором - колориметрическим с применением реактива Фолина.

В условиях проведения ферментативной реакции протеолитические ферменты солода не катализируют гидролиз животных белков - казеина и гемоглобина. Для осуществления гидролитического расщепления животных белков, в частности гемоглобина, протеолитическими ферментами солода в реакцию вводится активатор, в качестве которого используют цистеин.

Метод Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 1 г препарата или 1 см³ ферментного раствора за 1 час при температуре 40 ⁰С.

За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 час при принятых условиях опыта.

Аппаратура и реактивы: Водяная баня; весы технические; термометр; конические колбы вместимостью 50-100 см³; мерные цилиндры; пипетки; титровальная установка с микробюреткой; фосфатный буфер с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор гидроксида натрия; 96%-ный этиловый спирт; дистиллированная вода.

Приготовление фосфатного буфера с рН 7,3-7,5. Готовят из двух растворов: а) 11,876 г гидроортофосфата натрия Na₂HPO₄·2Н₂О в 1 дм³ дистиллированной воды; б) 9,078 г безводного дигидроортофосфата калия КН₂РО₄ в 1 дм³дистиллированной воды. Состав фосфатной смеси: 80 частей раствора Nа₂НРО₄ и 20 частей раствора КН₂РО₄.

Приготовление субстрата - 5%-ного раствора желатина. 5 г желатина предварительно замачивают в стеклянном стаканчике в 15-20 см³ дистиллированной воды в течение 20-30 мин. Набухший белок заливают 20-25 см³буферного раствора температурой 70-80 ⁰С и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Растворившуюся часть сливают в мерную колбу на 100 см³, к нерастворившейся части добавляют еще 20-25 см³буферного раствора и снова переносят полученный раствор в эту же колбу. Охлажденный до 40 ⁰С раствор желатина доводят до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина должен храниться в холодильнике при температуре от 2 до 5 ⁰С и может быть использован для анализа в течение 2 суток. Перед анализом раствор желатина нагревают до 40 ⁰С на водяной бане.

Приготовление 1%-ного спиртового раствора тимолфталеина. 1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в 96%-ном этиловом спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см³ и после растворения доводят до метки, закрывают пробкой и хранят в темном месте.

Приготовление 0,1 н раствор гидроксида натрия. 4 г кристаллического NаОН растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды. Определить поправку к титру.

Приготовление ферментной вытяжки. В колбе смешивают 1 часть солода с 5 частями дистиллированной воды температурой 37 ⁰С. Колбу плотно закрывают пробкой и содержимое взбалтывают в течение 1 часа на аппарате или вручную. Смесь фильтруют, перефильтровывая первые порции фильтрата, и для анализа используют прозрачный фильтрат.

Порядок проведения работы

К 10 см³5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 приливают 2 см³ испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см³ реакционной смеси в коническую колбу на 50-100 см³, куда предварительно налито 20 см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2 см³ раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1 н раствором NаОН. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02 см³.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в водяную баню с температурой 40 ⁰С для гидролиза. Через 3 часа 1 см³ реакционной смеси отбирают во во вторую коническую колбу на 50-100 см³, куда предварительно налито 20 см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2 см³ раствора тимолфталеина, и титруют аналогично контролю.

Расчет протеолитической активности ПС ведут по формуле:

ПА = А / (t · Р),

где А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t – время протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение в пересчете на 1 г солода или 1 см³ жидкого ферментного раствора.

Величина А рассчитывается по формуле:

А = (а - а_к)1,4 К,

где а – количество 0,1 н раствора NаОН, пошедшее на титрование 1 см³ опытной пробы, см³;

а_к – то же, для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в милиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.

Запись в лабораторном журнале производится по следующей форме:

Наименование показателя	1 повторность	2 повторность	Среднее значение
Влажность солода, %
Коэффициент разведения (Р)
Количество 0,1 н раствора NаОН, пошедшее на титрование 1 см³ опытной пробы (а), см³
Количество 0,1 н раствора NаОН, пошедшее на титрование 1 см³ контрольной пробы (а_к), см³
Протеолитическая активность солода (ПС), ед./г

Пример. На титрование 1 см³ опытной пробы пошло1,08 см³ 0,1 н раствора щелочи, а на титрование контрольной пробы – 0,68 см³. Время ферментолиза было 3 часа. Поправка к титру NаОН К = 1,06.

Следовательно: А = (1,08 – 0,68)1,4 ·1,06 = 0,59 мг.

Исходная 10%-ная вытяжка была приготовлена из сырой поверхностной культуры с влажностью 50 %, фильтрат вытяжки из культуры в количестве 2 см³ был добавлен к 10 см³ 5%-ного раствора желатина, из реакционной смеси на анализ отобрали 1 см³. Схема разведения такова: 10→100→ 2 →12→ 1.

Тогда ПС = А / (t · Р) = 0,59 · 12 · 100 / (3 · 1 · 2 · 10) = 11,8 ед на 1 г культуры.

Пересчет протеолитической активности на сухое вещество культуры ведется по формуле:

ПСсв = ПС · 100 / (100 - W) = 11,8 · 100 / (100 - 50) = 23,6 ед./г.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Назовите продукты гидролиза белка под действием протеиназ.

2. Какие ферменты относятся к группе протеиназ?

3. От чего зависит скорость расщепления белка протеолитическими ферментами?

4. Что используют в качестве белковых субстратов для определения протеолитической активности?

5. Какие способы определения протеолитической активности вы знаете и на чем они основаны?

Лабораторная работа №9

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 3167; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 678 9 10 11 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!