Определение активности БЭТТА-амилазы солода фотоколориметрическим методом

Цель работы:освоить методику определения активности β-амилазы солода фотоколориметрически.     

Общие положения

Сущность метода. В основе данного метода лежит определение скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала по количеству образовавшихся редуцирующих углеводов, которые определяют с по­мощью колориметрической реакции сахаров с 3,5-динитросалициловой кислотой. Реакция протекает в щелочной среде при нагревании в кипя­щей водяной бане. Динитросалициловая кислота восстанавливается сахарами в 3-амино-5-нитросалициловую кислоту, которая окрашивает раствор в яркий желто-оранжевый цвет.

Реакция идет по следующему уравнению:

По интенсивности окраски, полученной при реакции раствора, оп­ределяют содержание углеводов. Расчет ведут по мальтозе.

Поскольку оптическая плотность раствора прямо пропорциональна количеству образовавшихся при ферментативной реакции углеводов, строят график и находят число единиц активности осахаривающих фер­ментов, взятых для этой реакции.

Зависимость количества образовавшихся редуцирующих углеводов в процессе гидролиза крахмала от количества введенных в реакцию единиц ферментов различна вследствие специфичности ферментного комплекса материалов различного происхождения. В связи с этим для грибных материалов и солода составлены различные специальные гра­фики и уравнения, и этими уравнениями можно повседневно пользо­ваться при анализе данных продуктов.

За единицу осахаривающей активности ОСк.д. принимают такое ко­личество фермента, которое катализирует превращение 1 г крахмала за 60 мин при температуре 30° С и оптимальном рН в редуцирующие уг­леводы, составляющие 20% от количества взятого на ферментативную реакцию крахмала. Осахаривающая активность характеризуется числом единиц фермента в 1 г или 100 см³ исследуемого материала.

Аппаратура и реактивы: Фотоэлектроколориметр; ультратермостат или водяная баня; термометр; пробирки, пипетки, стеклянные палочки; мерные цилиндры; 1 %-ный раствор ДНСК; фосфатный буферный раствор с рН 4,8-4,9; дистиллированная вода.

Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 4,8-4,9. см. лабораторную работу № 6.

Приготовление раствора фермента. Солод измельчают, отбирают среднюю пробу. Навеску солода 5 г заливают 10 см³ фосфатного буфера с рН 4,8-4,9 и 90 см³ дистиллированной воды. Полученную суспензию для полного извлече­ния фермента выдерживают в течение 60 мин в термостате с температу­рой 30°С, периодически перемешивая стеклянной палочкой. Затем сус­пензию фильтруют. Для прове­дения ферментативной реакции используют рабочий раствор, который готовят из основного путем разбавления последнего (таблица 2).

Порядок выполнения работы

Для проведения реакции в две пробирки наливают по 10 см³ субстрата и ставят их в ультратермостат с постоянной температурой 30±0,2° С и выдержи­вают 5-10 мин. Затем в пробирки наливают по 5 см³ рабочих растворов фермента, нагретых до той же температуры (испытуемая проба). В кон­трольную пробу вливают инактивированный 15-минутным кипячением рабочий раствор фермента той же концентрации. Смеси быстро пере­мешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 10 мин.

Затем пробирки с испытуемой и контрольной жидкостью вынимают из термостата, содержимое перемешивают, отбирают из него по 1 см³ и переносят в пробирки с предварительно налитыми туда 4,5 см³ дистил­лированной воды и 2,5 см³ раствора ДНСК, которая прерывает действие фермента. Пробирки с содержимым вы­держивают 10 мин в кипящей водяной бане. В это время происходит колориметрическая реакция, и растворы приобретают желто-оранжевый цвет различной интенсивности в зависимости от количества редуци­рующих углеводов, образовавшихся в гидролизате. Затем растворы ох­лаждают и определяют их оптическую плотность на фотоэлектроколо-риметре, применяя кюветы с толщиной поглощающего слоя 5 мм и све­тофильтр с длиной волны 536 нм или близкой к ней. Колориметрирование проводят по инструкции, приложенной к каждому прибору.

Для обеспечения точности анализа необходимо, чтобы полученные значения оптических плотностей находились в пределах 0,150-0,750. Выше и ниже этих значений погрешность анализа за счет прибора уве­личивается. Наиболее точные данные получаются тогда, когда значение оптической плотности составляет 0,430-0,460. Если показания оптиче­ской плотности не укладываются в пределы 0,150-0,750, анализ повто­ряют. Для приготовления рабочего раствора берут больше или меньше основного раствора для разбавления. Если полученные данные уклады­ваются в указанные пределы, их используют для расчета осахаривающей активности.

Осахаривающую активность определяют по уравнениям, подставляя в них оптическую плотность раствора и количество препарата, взятого на анализ:

ОС_к.д = ,

 

где А - оптическая плотность раствора; а - количество солода, взятое на реакцию, мг.

 

Запись в лабораторном журнале производится по следующей форме:

Наименование показателя	1 повторность	2 повторность	Среднее значение
Влажность солода, %
ОС солода пред­полагаемая, ед./г
Оптическая плотность раствора (А)
Осахаривающая активность солода (ОС), ед./г

Пример. Определить ОСкд ячменного солода. Готовят вытяж­ку: 5 г солода на 100 см³ дистиллированной воды с фосфатным буфе­ром. Для приготовления рабочего раствора отбирают 2 см³ основного раствора, объем которого доводят до 100 см³ дистиллированной водой. В 5 см³ такого раствора содержится 5 мг солода (а = 5 мг). После анали­за получают раствор, оптическая плотность которого равна 0,420. Под­ставляя найденные величины в уравнение, рассчитывают осахаривающую активность солода:

ОС_к.д = = 33,92 ед./г.

 

Вопросы для самоконтроля знаний

1. В чем заключается сущность метода определения осахаривающей активности солода фотоколориметрическим методом?

2. Чем характеризуется осахаривающая активность?

3. По какому продукту реакции проводят расчет осахаривающей активности ферментов солода?

Лабораторная работа №8

---

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 1742; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!