Определение активности АЛЬФА-амилазы солода

Цель работы:освоить методику определения активности α-амилазы солода.

Общие положения

α-Амилаза чувствительна к кислотности среды, оптимум ее действия проявляется при рН от 5,7, в то время как β-амилаза может работать при бо­лее кислой реакции, она имеет оптимум действия при рН 4,2. Вместе с тем β -амилаза более термолабильна, чем α-амилаза, последняя выдер­живает более высокую температуру и ее температурный оптимум 66° С тогда как температурный оптимум β -амилазы 50° С.

α -Амилазы различаются по своей устойчивости к температуре. Наиболее быстро разрушается при нагревании грибная, более устойчи­вая к температуре - солодовая, и самая устойчивая к нагреванию - бак­териальная.

Амилазы гидролизуют как натуральные крахмальные зерна, так и крахмальный клейстер. Скорость расщепления крахмала амилазами различного происхождения зависит не только от активности ферментов, но также и от происхождения крахмала. Податливость крахмала к дей­ствию амилаз получила название атакуемости крахмала, которая увеличивается с уменьшением размеров зерен или, иначе говоря, с увеличением их относительной поверхности. Атакуемость крахмала амилазами возрастает также при механическом нарушении структуры крахмальных зерен. Однако действие амилазы на натуральные или даже механически поврежденные крахмальные зерна является весьма слабым по сравнению с действием на клейстеризованный крахмал.

Для обеспечения точности определения активности амилолитических ферментов в качестве субстрата применяют растворимый крахмал. Рас­твор такого крахмала является стабильным, атакуется в одинаковой степе­ни различными препаратами, а степень гидролиза растворимого крахмала зависит только от содержания ферментов в исследуемом продукте.

Как известно, крахмал состоит из амилозы и амилопектина разли­чающихся по физическим и химическим свойствам. Амилопектин рас­творяется в воде лишь при нагревании и дает очень вязкие растворы. Амилоза легко растворима в воде и дает растворы сравнительно невы­сокой стойкости. При выстаивании из них выпадает осадок (явление ретроградации). Амилоза практически не обладает восстанавливающей способностью, так как в каждой ее большой молекуле имеется лишь одна альдегидная группа.

Молекула амилозы имеет неразветвленную цепь, в которой остатки глюкозы связаны гликозидными связями между 1-м и 4-м углеродными атомами.

В молекуле амилопектина глюкозные остатки соединены глико­зидными связями не только между 1-м и 4-м углеродными атомами, но также между 1-м и 6-м.

Под действием ами­лазы происходит его ферментативное осахаривание. В качестве проме­жуточных продуктов при гидролизе крахмала в большем или меньшем количестве образуются декстрины - полисахариды разной молекуляр­ной массы. На первых стадиях гидролиза получаются декстрины, мало отличающиеся от крахмала по размерам молекулы и по свойствам. С йодом они дают синюю или фиолетовую окраску. По мере дальнейшего гидролиза молекулярная масса декстринов снижается, увеличивается их редуцирующая способность, и они в результате реакции с йодом начи­нают окрашиваться в темно-бурый, затем в красный цвет и, наконец, перестают давать с ним реакцию.

Модифицированный фотоколориметрический метод

Метод основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала, которую устанавливают по глубине превращения крах­мала под действием фермента с применением колориметрической реак­ции крахмала с йодом. Глубину превращения крахмала по полученным данным определяют отношением подвергшихся гидролизу α-амилазой гликозидных связей к первоначальному числу этих связей в субстрате до гидролиза.

За единицу активности α-амилазы принимают такое количество фермента, которое катализирует расщепление за 1 мин при рН 4,7 и температуре 30° С 1 мкмоль гликозидных связей в растворимом крах­мале при начальной его концентрации в инкубационной среде 1%.

Аппаратура и реактивы:ФЭК; водяная баня; термометры; мерные цилиндры; пробирки; стеклянные палочки; фосфатный буфер; 1 н ацетатный буфер с рН 4,7; 0,1 н раствор соля­ной кислоты; рабочий раствор йода; ферментные растворы, 2 % раствор крахмала.

Приготовление субстрата -  2 %-го раствора крахмала.

2 г растворимого крахмала с учетом влажности по­мещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ дис­тиллированной воды, помещают колбу с содержимым в кипящую водя­ную баню и выдерживают при непрерывном перемешивании до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, до­бавляют 20 см³ 1 н ацетатного буфера и доводят объем до метки дис­тиллированной водой при 20° С. Раствор крахмала готовят в день про­ведения анализа.

Приготовление фосфатного буфера. Готовят из двух растворов: а) 11,876 г гидроортофосфата натрия Na₂HPO₄•2Н₂О в 1 дм³ дистиллированной воды; б) 9,078 г безводного дигидроортофосфата калия КН₂РО₄ в 1 дм³ дистиллированной воды. Состав фосфатной смеси: 0,6-1,0 часть раствора Nа₂НРО₄ и 99 частей раствора КН₂РО₄.

Приготовление ацетатного буфера рН 4,7. Готовят из двух растворов: а) 57,25 см³ ледяной уксусной кислоты СН₃СООН растворяют в 1 дм³ раствора; б) 82 г без­водного ацетата натрия CH₃COONa растворяют в 1 дм³ раствора. Состав ацетатной смеси: 50 см³  раствора уксусной кислоты и 50 см³ раствора ацетата натрия.

Приготовление рабочего раствора йода.

Основной раствор йода.0,5 г металлического йода и 5 г йодида калия взвешивают на лабораторных весах с точностью до 0,01 г в тари­рованной бюксе с притертой крышкой и добавляют 2 см³ дистиллиро­ванной воды. Бюксу закрывают и содержимое перемешивают. После полного растворения йода раствор количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 200 см³, доводят до метки дистиллированной водой при 20° С и содержимое перемешивают. По­лученный раствор хранят в темном месте и используют для анализа в течение 30 суток с момента приготовления.

Рабочий раствор йода.Готовят ежедневно перед началом ана­лиза из основного раствора. В мерную колбу на 100 см³ вносят 2 см³ основного раствора йода, доводят объем жидкости до метки 0,1 н рас­твором соляной кислоты. Полученный раствор перемешивают и опре­деляют его оптическую плотность на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при светофильтре с длиной волны 453 нм. Оптическая плотность рабочего раствора йода должна быть равна 0,220. При отклонении от указанной величины добавляют не­сколько капель раствора кислоты или основного раствора йода, добиваясь, чтобы раствор имел необходимое значение оптической плотности.

Приготовление ферментной вытяжки.  Анализируемый солод измельчают на механической или ручной мельнице, отбирают среднюю пробу и определяют влажность. Навеску 5 г заливают 10 см³ фосфатного буфера с рН 4,8-4,9 и 90 см³ дистиллированной воды. Полученную суспензию для полного извлече­ния фермента выдерживают в течение 60 мин в термостате с температу­рой 30° С, периодически перемешивая стеклянной палочкой. Затем сус­пензию фильтруют, и фильтрат используют в качестве основного рас­твора для определения амилолитической активности солода. Для прове­дения ферментативной реакции используют рабочий раствор, который готовят из основного путем разбавления последнего (таблица 2).

Таблица 2  Получение рабочего ферментного раствора из ячменного солода в зависимости от его активности

АС солода пред­полагаемая, ед./г	Предполагаемое содержание солода в 5 см3 рабочего раствора, мг	Количество основно­го раствора, необхо­димое для вторичного разбавления, см3	Общий объем разбавленного раствора, см3
15-20	20,0	4	50
21-30	10,0	2	50
31-50	7,5	3	100

 

 Порядок выполнения работы

Берут две пробирки, наливают в каждую по 5 см³ субстрата и ставят в ультратермостат с температурой 30±0,2° С. Пробирки с содержимым выдерживают при этой температуре 10 мин. Одновременно прогревают при данной температуре ферментный рас­твор и дистиллированную воду. Затем в одну пробирку вносят 5 см³ дистиллированной воды (контрольная проба), в другую - 5 см³ фер­ментного раствора (опытная проба). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в ультратермостате при температуре 30±0,2°С в течение 10 и 20 мин. Через 10 и затем через 20 мин из реакционных смесей от­бирают по 0,5 см³ раствора и переносят в колбы, куда предварительно наливают по 50 см³ рабочего раствора йода. Реакционные смеси выдер­живают 20 мин при комнатной температуре, после чего измеряют оптиче­скую плотность окрашенных растворов (опытного и контрольного) на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя красный светофильтр (λ = 650 нм).

Получают ряд значений оптической плотности А₁ опытных раство­ров, определяемых через 10 и 20 мин (A₁₀ и А₂₀), а также контрольных растворов при этих температурах (А_к).

α -Амилазную активность рассчитывают по формуле

АС = ,

где А₁ и А_к - оптическая плотность исследуемого и контрольного растворов; а -содержание ферментного препарата в реакционной среде, г/см³ ; t - время ин­кубации, мин, 4,11 - постоянный коэффициент.

Запись в лабораторном журнале производится по следующей форме:

Наименование показателя	1 повторность	2 повторность	Среднее значение
АС солода пред­полагаемая, ед./г
Время инкубации 10 мин
Оптическая плотность исследуемого раствора (А1)
Оптическая плотность контрольного раствора (Ак)
АС10, ед./г
Время инкубации 20 мин
Оптическая плотность исследуемого раствора (А1)
Оптическая плотность контрольного раствора (Ак)
АС20, ед./г
α -амилазная активность (АС), ед./г

 

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Что такое субстрат?

2. рН оптимум действия α-амилазы .

3. Температурный оптимум действия α-амилазы.

4. Что является субстратом для действия α-амилазы?

5. На какие связи дейтвует α-амилаза?

6. Раскройте понятие атакуемости крахмала.

7. Назовите продукты гидролиза крахмала под действием α-амилазы по стадиям.

Лабораторная работа №6

---

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 2216; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

---

Мы поможем в написании ваших работ!