Иммунологические методы в диагностике инфекционных заболеваний

Иммунологические методы используются в диагностических исследованиях, проводящихся в двух направлениях:

• иммунодиагностика инфекционных заболеваний;

• характеристика функционального состояния иммунной системы.

Для инфекционных заболеваний характерно наряду с неспецифическими проявлениями патологии появление во внутренней среде организма также специфических для данного возбудителя (антигены, токсины и т.п.) и иммунного ответа.

Иммунодиагностика инфекционных заболеваний включает в себя: 1) специфическое распознавание маркеров возбудителя и реагирующих с микробными продуктами комплементарных структур (антител, рецепторов клеточной поверхности, участков молекул нуклеиновых кислот); 2) определение изменения функциональной активности различных компонентов иммунной системы (количества и функциональной активности лимфоцитов, соотношения их субпопуляций, активности клеток фагоцитарной системы, концентрации иммуноглобулинов и т.п.).

В основе наиболее часто используемого для выявления антител или антигенов иммунохимического анализа лежит формирование иммунного комплекса антиген-антитело в результате взаимодействия антигенной детерминанты с комплементарной областью иммуноглобулина (активный центр). В процессе реакции антиген-антитело происходит возникновение мультимолекулярных комплексов при участии огромного числа молекул антигена и антител и формирование воспринимаемого визуально преципитата. Преципитационные методы проводятся в растворе (нефелометрия и турбодиметрия, основанные на рассеивании света частицами преципитата) или в геле (иммунодиффузия и иммуноэлектрофо-рез). В настоящее время наиболее распространена одиночная радиальная иммунодиффузия по О.Мапст! для количественного анализа (антиген радиально диффундирует из лунки в гель, содержащий антитела, причем образуется область преципитации, площадь которой прямо пропорциональная количеству антигена в лунке) и двойная радиальная иммунодиффузия для качественной ха-

рактеристики (антиген из центральной лунки и антитела из радиально расположенных вокруг лунок диффундируют навстречу друг другу, образуя или нет полосы преципитации, что позволяет делать вывод об антигенных свойствах данного антигена). К иммуноэлектрофоретическим методам относятся методики, основанные на явлении миграции компонентов иммунных комплексов в электрическом поле. Электрофорети ческое разделение смеси антигенов в геле сочетается с пре-ципитационным выявлением их с помощью двойной ^ммунодиффузии-

Для диагностики инфекций параллельно с методами преципитации, начиная с конца 19 века, широко использовались методы, в основе которых лежит взаимодействие корпускулярных антигенов (эритроциты, бактериальные клетки) с антителами (прямая агглютинация). Методы пассивной агглютинации используют частицы, сенсибилизированные антигенами или антителами, для выявления бактериальных и вирусных антигенов или антител к ним.

В настоящее время наиболее широко распространены индикаторные методы, использующие для выявления реакции антиген-антитело различного рода метки (радиоактивные, флюоресцентные. ферментные).

Методики, при выполнении которых наличие иммунного комплекса выявляется с помощью радиоактивной метки, введенной предварительно в состав одного из компонентов (антитела или антигена), называются радиоиммунноло-гическим анализом (РИА). Наиболее известны 2 разновидности РИА; радиоим-мунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФРИА). Количественный анализ преципитата, образовавшегося в процессе РИП, проводится с помощью счетчиков радиоактивности либо с помощью ауто-радиографии. Использование ТФРИА, в котором антиген или антитело изначально иммобилизуется на больших по размерам частицах или пластике, а при проведении реакции на иммобилизованный компонент сорбируются остальные, дает возможность удалятьиз реакционной смеси не вошедшие в иммунный комплекс макромолекулы с помощью простой отмывки.

В клинической практике нашли широкое применение иммунофлюоресцен-тные методы, использующие антигены или антитела с введенными в их состав флюоресцентными метками. О наличии или отсутствии иммунного комплекса, сформированного в результате реакции антиген-антитело, судят по интенсивности флюоресценции. Наиболее распространенными являются два варианта (прямой и "сэндвич" методы) иммунофлюоресцентной микроскопии (ИФМ). ИФМ позволяет не только удостовериться в наличии антигена вирусов или бактерий в клиническом образце, но и установить локализацию его в определенных клеточных или субклеточных структурах.

В настоящее время интенсивно развиваются более чувствительные методики с использованием для метки антигенов или антител положительно заряженных ионов редкоземельных элементов — лантанидный иммунофлюоресцен-тный анализ (ЛИФА).

Особенно широко в последние годы в медицине используется твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА или Е1-15А). В качестве индикаторной молекулы в ИФА используется молекула фермента. Чувствительность ИФА может быть очень высокой, так как одна молекула фермента может модифицировать большое число молекул субстрата. Один из участников реакции антиген-антитело иммобилизуется на твердом носителе. Для обнаружения в клинических образцах бактериальных или вирусных антигенов на твердую подложку (полисте-рол) последовательно сорбируются первичные антитела, выявляемый антиген И вторичные антитела с введенной в них ферментной меткой. Для обнаружения

386

антител в биологических жидкостях антиген иммобилизуется на твердом носителе, затем исследуемая сыворотка контактирует с иммуносорбентом. Адсорбция специфических к данному антигену антител выявляется с помощью меченых антивидовых антител.

Благодаря развитию молекулярной биологии и генетических исследований, разрабатывается направление в диагностике, использующее методы генного зондирования, в основе которых лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации (образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов: А-Т, Г-Ц). Основной принцип генного зондирования (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется способами индикаторных методов иммунодиагностики, при использовании тех же индикаторов (радиоактивные изотопы, флюоросцеины, биотин). На присутствие инфекционного агента проводится анализ образцов сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов, цельной крови и т.п. Осуществляется лизис клеток, денатурация ДНК (переход в одноцепочечную форму), затем фиксация на носителе (нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране), инкубация в вакууме при 80°С, гибридизация с зондом (участки ДНК или РНК, выдепенные из возбудителя или синтезированные химически олигонуклеотиды), детекция образовавшегося комплекса. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет увеличить концентрацию определенной последовательности ДНК в пробе за счет синтеза многочисленных копий \п уИго. Для этого к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат ДНК-полимеразы, избыток ол иго нуклеотидов и 2 праймера, соответствующие концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Затем производится плавление (денатурация ДНК). ПЦР позволяет существенно повысить чувствительность анализа, что важно при низком содержании возбудителя или при исследовании субмикроскопического количества патологического материала.

Вторым важным направлением использования иммунологических методов является характеристика функционального состояния отдельных звеньев иммунной системы и факторов неспецифической защиты, взаимодействующих с ними. Выявление дефицита какого-либо из них позволяет своевременно начать соответствующую и ммун о корригирующую терапию.

Среди большого набора тестов, существующих в настоящее время для оценки любого компонента иммунной системы, выделяют тесты, с помощью которых можно диагностировать наиболее частые нарушения или получить наиболее важную информацию о состоянии иммунной системы, так называемые тесты 1-го уровня. Они дают возможность выявить грубые поломки в иммунной системе. Тесты 2-го уровня позволяют установить их механизмы.

Для оценки активности системы фагоцитов используют тесты 1 -го уровня:

абсолютное число нейтрофилов и моноцитов, интенсивность поглощения микробов фагоцитами, способность фагоцитов убивать микробы.

Нейтрофилы, являясь одним из активных факторов в системе клеточно-гуморальной кооперации, принимают непосредственное участие не только в противомикробной, но и в противовирусной защите через феномен антитело-зависимой клеточной цитотоксичности либо путем прямой адсорбции вирусов на поверхности клетки с последующим фагоцитозом и дезинтеграцией их в фа-гол и зосо мах.

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов проводится с использованием методов, основанных на способности этих клеток к поглощению корпускулярных агентов, находящихся всреде, фагоцитарное число (среднее числочас-

387

тиц, поглощенных одной клеткой) и фагоцитарный индекс (число активнофаго-цитирующих клеток) определяются после инкубирования клеток частицами латекса или эритроцитами. Широко используемым чувствительным и информативным способом оценки функционального состояния нейтрофилов является тест восстановления нитросинего тетразолин (НСТ). Восстановление НСТ в фагоците прямо зависит от эффективности метаболических путей в клетке, в которой вырабатываются активные формы кислорода с выраженными антимикробными свойствами. Усиленная активация кислородного метаболизма у фагоцитов является одним из самых чувствительных индикаторов возбуждения поли- и моно-нуклеарных фагоцитов, хотя и косвенным критерием фагоцитарной активности. Она может регистрироваться также с помощью хемилюминесценции. Важным принципом исследования фагоцитов в клинике является выяснение способности клеток реагировать на стандартный стимул, что может служить показателем их функционального резерва.

Применяемые для оценки интенсивности хемотаксиса фагоцитов и экспрессии молекул адгези и (СОИ а, СОПЬ, С011с и др.) на поверхностной мембране нейтрофилов методы относятся ктестам 2-го уровня.

Оценка В-системы иммунитета проводится с использованием следующих методов: 1) определение иммуноглобулинов О, А, М в сыворотке крови; 2) определение иммуноглобулинов Ев сыворотке крови; 3) определение количества В-лимфоцитов.

Важным параметром служит концентрация иммуноглобулинов, которая определяется в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии или методом нефелометрии. Отклонения в уровнях иммуноглобулинов могут быть связаны с инфекцией, поликлональной активацией, аутоиммунным процессом. Иммуно-дефициты, связанные с биосинтезом антител, проявляются прежде всего в виде длительно протекающих рецидивирующих инфекций респираторного тракта, хронических синуситов, отитов и др. Дефицит 1дА ассоциируется с аутоиммунными и аллергическими заболеваниями, при которых часто повышен уровень 1дЕ.

Наиболее важными тестами 2-го уровня являются: определение субклассов иммуноглобулинов, особенно 1дС, секреторного 1дА, специфических антител к белковым и полисахаридным антигенам, способности лимфоцитов отвечать пролиферацией на В- (липополисахарид, стафилококк) и Т-В-митогены (ми-тоген лаконоса). Определение дефицита по субклассам !д0 может иметь определенную диагностическую значимость. Например, дефицит !дй2, содержащих преимущественно антитела против полисахаридов инкапсулированных бактерий, ведет к повышенной заболеваемости респираторными инфекциями.

С разработкой гибридомной техники появились уникальные возможности использовать моноклональные антитела как инструмент изучения и идентификации различных популяций и субпопуляций лимфоцитов по наличию на поверхности клеток структур с определенными свойствами и тканевой специфичностью (12). Все основные антигенные маркеры лимфоцитов и других клеток иммунной системы в соответствии с международной классификацией получили название кластеров дифференцировки (СО), Используя меченные флюорохро-мами моноклональные антитела, с помощью флюоресцентной микроскопии или проточной цитофлюорометрии можно определить процент и абсолютное количество В-лимфоцитов (С019, С020) в периферической крови.

Оценку Т-системы иммунитета проводят с применением тестов 1-го уровня: общего числа лимфоцитов, процента и абсолютного числа зрелых Т-лимфо-цитов (СОЗ) и двух основных их субпопуляций (С04 и С08), пролиферативного

388

ответа на Т-митогены (ФГА и Кон А). Выявление нарушений в Т-клеточном звене иммунитета имеет диагностическую ценность, так как для них характерны пневмонии, вызванные Рпеитасузйссаппп, хронический кандидоз, хроническая диарея, токсоплазмоз, атипические микобактериальные инфекции, цитомегалови-русная инфекция и т.д., —заболевания, где этиологическим фактором являются факультативно- и обл и гатно-внутри клеточные паразиты.

Оценка функциональной активности Т-системы иммунитета исключительно важна, так как она может быть существенно изменена при нормальном количестве Т-клеток и их субпопуляций. Наиболее простым методом оценки функциональной активности лимфоцитов является реакция бласттрансформации, которую оценивают по способностиклеток отвечать пролиферацией на митогены (фитогем агглютинин, конканавалин А, митоген лаконоса). О пролиферативной активности судят по включению радиоактивной метки в ДНК лимфоцитов, которую определяют по числу сцинтилляций с помощью р-счетчика радиоактивности. Пролиферативный ответ на митогены понижен практически при всех хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях, при иммунодепрессивной терапии, при СПИДе, первичных Т-клеточных иммунодефицитах.

Определение продукции цитокинов, пролиферативного ответа на специфические антигены, кожные тесты с микробными антигенами относят к тестам 2-го уровня. Выявление нарушения синтеза ИЛ-2 сочетается с повышением чувствительности организма к внутриклеточным микроорганизмам. Велика роль провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1,у-ИФН) в этиопатогенезе различных острых и хронических воспалительных процессов инфекционной и аутоиммун-ной природы. Провоспалительные иммуноцитокины, секретируемые моноцитами и лежащие в основе запуска каскада иммунопогических и острофазовых воспалительных реакций, связаны с развитием инфекционного заболевания. Повышенное образование этих цитокинов определяется в случаях бактериальных инфекций. На фоне антибактериальной терапии концентрация их снижается. Сохранение ги пер продукции провоспалительных цитокинов и выявление высоких их уровней в сыворотке крови и/или ликворе расценивается как неблагоприятный прогностический признак, так как часто сопровождается развитием септического шока и летальным исходом (13).

Наиболее часто исследуемыми в клинике цитокинами являются интерфе-роны, обладающие антивирусной, антипролиферативной и иммуномодулирую-щей активностью. В ответ на стимуляцию вирусами или клеточными активаторами лейкоциты и макрофаги продуцируют ИФН-а (лейкоцитарный), фиброблас-ты и эпителиальные клетки ИФН-р (фибробластный), Т-лимфоциты ИфН-у (иммунный). Определение интерферонового статуса у больных проводят путем количественного измерения титра сывороточного ИФН, уровня спонтанной продукции ИфН лейкоцитами, интерфероновой реакции лейкоцитов в ответ на индукторы ИФН: ИФН-а — вирус болезни Ньюкастла (ВБН), — ИФН-а,р — ридос-тин, ИФН-у — фитогемагглютинин. За единицу активности ИФН принимают величину, обратную его разведению, ингибирующую на 50% цитопатическое действие вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) на монослой клеток-фиброб-ласговМ-19. Для больных с инфекционными заболеваниями характерно повышение уровня сывороточного и спонтанно продуцируемого !п УИто ИФН при сниженной способности к индуцированному синтезуИФН.

Одной из причин инфекционно-воспалительных заболеваний новорожденных является интраамниотическая инфекция (ИАИ). Ранний диагноз ИАИ труден в связи с поздним появлением клинических симптомов. При лабораторном исследовании амниотической жидкости также не существует золотого стандарта.

389

В последнее время к таким методам как подсчет лейкоцитов, окраска мазков по Граму, культуральные тесты, определение активности лейкоцитарной эстеразы и концентрации глюкозы, присоединяется идентификация интерлейкинов. Высоко предсказательным в отношении микробной инвазии амниотической жидкости и неонатальной заболеваемости недоношенных новорожденных является определение одного из главных провоспалительных цитокинов, которые опос-редуют ответ хозяина на инфекцию, —ИЛ-6 (14). Определение воспалительных медиаторов ассоциируется с гистологически диагностируемой предродовой инфекцией и церебральными параличами. Найдена высокая связь повреждения белого вещества головного мозга у новорожденных, отнесенных в группу риска по выявлению присутствия гистологических хориоамнионитов и повышенных концентраций ИЛ-6 и ИЛ-1 (15,16).

Даже краткое описание арсенала методов, существующих в настоящее время, позволяет представить себе методические возможности для оценки состояния защитных средств организма.

Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 1197; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 58 59 60 61 626364 65 66 67 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!