Лабораторная работа 10. Определение активности аминотрансфераз
Активность аминотрансфераз (прежде всего аланин- и аспартатаминотрансферазы – АлАТ и АсАТ, соответственно) рассматривается как один из важных показателей обмена белков и аминокислот.
Принцип метода: вследствие аминирования α-кетоглутарата L-аланином, которое происходит под действием АлАТ, образуются пируват и L-глутаминовая кислота. Определение основано на измерении оптической плотности 2,4-динитрофенилгидразонов α-кетоглутарата и пирувата в щелочной среде. Поскольку гидразон пировиноградной кислоты имеет более высокий коэффициент молярной экстинции, то проявляется прямо пропорциональная зависимость оптической плотности реакционного раствора от активности фермента
Материалы и реактивы:
1. Субстратно-буферный раствор АлАТ:
- фосфатный буфер (0,1±0,005) мМ
- D, L- аланин (0,2±0,01) М
- 2-оксоглутаровая кислота (2±0,1) М
2. Стоп реагент (раствор 2,4-динитрофенилгидразина)
- (1±0,05) ммоль/л в растворе соляной кислоты (1±0,05) мМ
3. Калибровочный раствор - пировинограднокислого натрия (2±0,1) ммоль/л, (220±11) мг/мл (что соответствует 176 мкг/мл пировиноградной кислоты)
4. Раствор гидроокиси натрия (4±0,2) М или сухой NaOH
Ход работы:
Анализ проводиться согласно схеме, приведенной в таблице 1.
Таблица 1
| Отмерять в пробирку, Мл | Опытная или калибровочная проба | Холостая проба |
| Субстратно-буферный раствор | 0,4 | 0,4 |
| Инкубировать 3 мин. при + 37 0С | ||
| Стоп реагент | - | 0,4 |
| Сыворотка крови | 0,08 | 0,08 |
| Инкубировать 60 мин. при +37 0С | ||
| Стоп реагент | 0,4 | - |
| Выдерживать 20 мин. при комнатной температуре | ||
| Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н | 4,0 | 4,0 |
| Выдерживать 10 мин. при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность опытной пробы против холостой. |
|
|
|
Расчет активности фермента в сыворотке крови проводят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика проводится в соответствии с таблицей 2.
Таблица 2 – Калибровочный график для 1 часа инкубации
| Отмерять в пробирку, мл | Калибровочные точки | Контрольная проба | ||||
| Субстратно-буферный раствор | 0,45 | 0,40 | 0,35 | 0,30 | 0,25 | 0,5 |
| Калибровочный раствор | 0,05 | 0,10 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | - |
| Дистиллированная вода или физиологический раствор | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Стоп реагент | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Выдержать 20 мин. при комнатной температуре | ||||||
| Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 |
| Выдержать 10 мин. при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность калибровочных проб против контрольной. Фотометрирование проводится, как для опытного образца. При построении калибровочного графика на оси абсцисс – величины активности АлАТ, выраженные в микромолях пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации. | ||||||
| Содержание пировиноградной кислоты в калибровочной пробе | ||||||
| Мкмоль | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,0 |
| Мкг | 8,8 | 17,6 | 26,4 | 35,2 | 44,0 | 0,0 |
| Активность в мкмоль/час.×мл | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 0,0 |
| мккат/л | 0,278 | 0,556 | 0,833 | 1,11 | 1,39 | 0,0 |
|
|
|
Линейность калибровочного графика должна сохраняться до величины экстинкции 0,35.
Нормальная активность АлАТ в сыворотке крови составляет (0,1-0,68) мкмоль/час×мл при +37 0С.
Клинико-диагностическое значение. Диагностическое значение имеют две аминотрансферазы: АлАТ и АсАТ. Повышение их активности в крови является чувствительным показателем нарушения функций печени и сердца.
Для диагностики инфаркта миокарда проводят определение активности следующих ферментов: АлАТ, АсАТ, креатинкиназы, ЛДГ. При инфаркте миокарда активность АсАТ в сыворотке крови поднимается, начиная с 8-12 часа; максимальная активность достигается через 24-36 часов, а её возвращение
К нормальному уровню происходит на 4-6 день. У больных с инфарктом миокарда активность АсАТ в сыворотке крови в 2-10 раз выше от верхнего значения нормы. Соотношение активности АлАТ/АсАТ при инфаркте миокарда в большинстве случаев превышает 2, а соотношение меньше 1 преимущественно указывает на поражения печени.
|
|
|
Повышенная активность ферментов в сыворотке крови при заболеваниях печени является следствием повреждения гепатоцитов. Такие повреждения, независимо от причины, вызывают увеличение активности аминотрансфераз не менее чем в 10 раз. Токсическое повреждение печени, например, при отравлении парацетамолом, приводит к повышению активности АлАТ и АсАТ в 50-100 раз. Значительное возрастание активности аминотрансфераз выявляют при вирусном гепатите.
Дата добавления: 2016-01-05; просмотров: 65; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!