Темы для рефератов и самостоятельной работы
Используя ответы на поставленные вопросы, дополнить таблицу аминокислот (Приложение 1) и таблицу витаминов (Приложение 2).
1) Основные метаболические превращения фенилаланина и тирозина, ферменты. Реакции синтеза гормонов и медиаторов (катехоламины, тиреоиды) из фенилаланина и тирозина, роль витамина С.
2) Биохимические дефекты при фенилкетонурии, алкаптонурии и альбинизме, характерные особенности заболеваний.
3) Пути использования глицина в организме. Реакции синтеза глицина из серина и треонина, ферменты.
4) Реакции катаболизма глицина, образование производных тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФК).
5) Вещества, синтезирующиеся при участии производных ТГФК, причина нарушения их синтеза при гиповитаминозе фолиевой кислоты. Связь фолиевой кислоты с антибактериальной активностью сульфаниламидных препаратов, работа в тандеме с витамином В12.
6) Реакции синтеза серина. Роль серина в биосинтетических процессах.
7) Серосодержащие аминокислоты. Метаболические превращения цистеина и его серы.
8) Реакция образования аденозилметионина, его роль в процессах трансметилирования, значение для пути синтеза креатина и креатинина, синтеза адреналина, фосфатидилхолина.
9) Катаболизм триптофана, метаболиты процесса, их значение. Причины развития пеллагры при недостатке триптофана в пище. Нарушения обмена триптофана при болезнях "моча с запахом кленового сиропа" и Хартнупа.
|
|
|
10) Особенности обмена дикарбоновых аминокислот и их амидов, связь обмена аминокислот с цитратным циклом, их участие в процессах биосинтеза.
11) Аминоацидурия. Причины гипераминоацидурии, метаболические дефекты при цистинозе, цистинурии, гепатоцеребральной дистрофии.
Лабораторная работа 1.
Определение активности аминотрансфераз
сыворотки крови
Актуальность
Трансаминирование ‑ обратимый перенос a‑аминогруппы аминокислоты на кетокислоту без промежуточного отщепления аммиака. Процесс катализируют аминотрансферазы (АсАТ, АлАТ и др.), их коферментом выступает пиридоксальфосфат. Процесс протекает в печени, почках, сердце, скелетных мышцах. В сыворотке крови активность аминотрансфераз низка, она резко возрастает при нарушении целостности мембран клеток тканей и органов.
Материал для исследования
Сыворотка крови.
Принцип
В результате переаминирования, происходящего под действием АсАТ и АлАТ образуются оксалоацетат и пируват. Оксалоацетат, подвергаясь декарбоксилированию, превращается в пируват. При добавлении кислого 2,4‑динитро-фенилгидразина (ДНФГ) энзиматический процесс останавливается, получается гидразон пировиноградной кислоты, который в щелочной среде дает окрашивание с интенсивностью, пропорциональной количеству образовавшегося пирувата.
|
|
|
Реактивы
1) 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4, 2) 0,04 % раствор бромтимолового синего, 3) Раствор субстрата АсАТ: смесь 2‑оксоглутаровой и аспарагиновой кислот, 4) Раствор субстрата АлАТ: смесь 2‑оксоглутаровой кислоты и аланина, 5) Раствор ДНФГ в 1 М HСl, 6) 0,4 М раствор NaOH, 7) 0,1 мкМ эталонный раствор пировиноградной кислоты.
Проведение анализа
| 1 проба, стандартная, мл | 2 проба, опытная для АлАТ, мл | 3 проба, опытная для АсАТ, мл | |
| Субстратный р‑р АлАТ Субстратный р‑р АсАТ Эталонный раствор Сыворотка | 0,25 ‑ 0,05 ‑ | 0,25 ‑ ‑ 0,05 | ‑ 0,25 ‑ 0,05 |
| Инкубируют 60 мин при 37°С | |||
| 2,4‑ДНФГ | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Инкубируют 20 мин при 20‑25 °С | |||
| NaOH | 2,5 | 2,5 | 2,5 |
| Пробы инкубируют 10 мин при комнатной температуре, колориметрируют против контроля (буфер) при зеленом светофильтре (500‑560 нм) | |||
Расчет
Активность АлАТ, ммоль/л×час= 
Активность АсАТ, ммоль/л×час= 
,
где: ЕСТ, ЕОП2, ЕОП3 — оптическая плотность стандартной пробы и опытных проб (для АлАТ, АсАТ соответственно), Сст — концентрация стандартного раствора.
Нормальные величины
|
|
|
Сыворотка: активность АлАТ 0,1‑0,68 ммоль/л×час
активность АсАТ 0,1‑0,45 ммоль/л×час
Коэффициент де Ритиса (АсАТ/АлАТ) 1,33±0,40
Клинико-диагностическое значение
Определение активности АсАТ, АлАТ и их соотношения используют для выявления патологических процессов различных органов. В миокарде выше активность АсАТ, чем АлАТ, в печени наоборот. При инфаркте миокарда значительно увеличивается активность АсАТ в сыворотке крови и коэффициент АсАТ/АлАТ. При поражении печени (цирроз, сывороточный гепатит) больше растет активность АлАТ, коэффициент АсАТ/АлАТ снижается.
Оформление работы
Указывают принцип метода, регистрируют результаты анализа, производят расчеты и делают вывод.
Лабораторная работа 2.
Определение аминокислот методом
распределительной хроматографии на бумаге
Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков, углеводов, липидов и их метаболитов. Существует несколько видов хроматографии. Довольно точен и доступен метод распределительной хроматографии на бумаге (модификация адсорбционной хроматографии), где в качестве адсорбента используют специальную фильтровальную бумагу. Хроматографию проводят в закрытой камере, чтобы избежать испарения растворителей хроматографической смеси.
|
|
|
Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге используют для определения аминокислотного состава белков, качественного и количественного определения аминокислот в биологических жидкостях и тканях. В научных лабораториях применяют автоматические анализаторы аминокислот с высокой чувствительностью и скоростью проведения анализа.
Принцип
Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой ‑ водонасыщенный органический растворитель, например, бутанол. Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен быть полярным (неподвижная фаза), а другой неполярным ‑ подвижная фаза. Более гидрофобная аминокислота, лучше растворяющаяся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого отдельные аминокислоты по окончании хроматографического разделения оказываются на разном расстоянии от линии старта.
Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель перемещается от центра к периферии, захватывая аминокислоты, которые распределяются концентрическими кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции.
Реактивы
1) растворы аминокислот‑свидетелей ‑ глицина, аланина, лейцина (0,04 моль/л, 2) хроматографическая смесь (бутанол : уксусная кислота : вода, 1,5 : 1,5 : 1,0), 3) 0,2% спиртовый раствор нингидрина, 4) задача ‑ смесь растворов определяемых аминокислот.
Оборудование
Термостат 37°С, сушильный шкаф 100°С, пульверизатор, чашки Петри, хроматографическая бумага (d=12 см), стеклянные капилляры или микропипетка.
Проведение анализа
Диск бумаги следует держать за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме.
1) Диск специальной хроматографической бумаги делят на 4 сектора, которые маркируют согласно исходным растворам. В центре хроматограммы делают отверстие диаметром около 0,3 см и вставляют фитиль из скрученной полоски бумаги, высота фитиля равна высоте чашки Петри.
2) На расстоянии 1,0 см от центра карандашом отмечают линию старта, на которую в соответствующих секторах стеклянными капиллярами или микропипеткой наносят раствор аминокислот-свидетелей и исследуемую смесь аминокислот.
3) Высушивают хроматограмму на бумажном диске на воздухе до полного исчезновения влажных пятен.
4) Хроматограмму помещают в заранее приготовленную хроматографическую камеру (чашку Петри) на 1/3 заполненную хроматографической смесью. Разделение проводят при комнатной температуре под визуальным контролем (примерно в течение 30 мин).
5) Когда фронт растворителя достигнет границ бумажного диска, разделение прекращают, отмечают карандашом по всей окружности линию фронта.
6) Хроматограмму высушивают в сушильном шкафу при температуре 90‑100°С с целью устранения растворителей и фиксации аминокислот.
7) Хроматограмму опрыскивают раствором нингидрина с помощью пульверизатора (либо смачивают раствором, налитым в чашку Петри) и помещают в сушильный шкаф при 100°С (или прогревают над электроплитой). На бумаге проявляются красноватые, пурпурно-красные, чаще ‑ сине-фиолетовые пятна, соответствующие расположению различных аминокислот.
Рассчитывают по полученной хроматограмме коэффициент распределения Rf для каждой аминокислоты:
Rf = а/b,
Аминокислоты-"свидетели": Смесь аминокислот (сектор 4):
(сектор 1) Rf аланина = а/b 1 Rf = а/b
(сектор 2) Rf лейцина = а/b 2 Rf = а/b
(сектор 3) Rf глицина = а/b 3 Rf = а/b
где: а ‑ расстояние, пройденное от линии старта аминокислотой (мм),
b ‑ расстояние, пройденное от линии старта фронтом растворителя (мм).
Идентифицируют аминокислоты, находящиеся в исследуемом растворе (сектор 4), путем сравнения их положения (Rf) с положением (Rf) соответствующих аминокислот, используемых в качестве "свидетелей" (сектора 1, 2, 3).
Нормальные значения содержания аминокислот
Плазма крови около 21,42 ммоль/л
Моча до 0,5 г /сут
Практическое значение
Определение свободных аминокислот важно для изучения белкового обмена. Изменения в содержании аминокислот в сыворотке крови и моче наблюдаются при недостаточности печени, усиленном распаде белков, нарушении обмена аминокислот, выделительной функции почек. Недостаток аминокислот (нарушения переваривания белка в желудочно-кишечном тракте, потеря белка при патологии почек и др.) сказывается, в первую очередь, на сердечной мышце, а также может усугублять течение пародонтита и пародонтоза. При врожденных дефектах метаболизма аминокислот увеличивается концентрация в крови и усиливается экскреция с мочой одной или нескольких аминокислот.
Оформление работы
Указывают принцип метода, делают измерения и расчеты по хроматограмме. В выводе поясняют причины разделения аминокислот на хроматогрмме, клинико-диагностическое значение оценки аминокислот в сыворотке крови и моче.
Лабораторная работа 3.
Реакция Феллинга на обнаружение фенилпирувата в моче
Принцип
Фенилпируват при взаимодействии с FeCl3 образует комплексное соединение оливково-зеленого цвета.
Реактивы
10,0 % раствор FeCl3.
Материал для исследования
Моча.
Проведение анализа
В пробирку вносят 10 капель мочи, 5 капель FeCl3. При наличии в моче фенилпирувата, через 2‑3 мин появляется оливково-зеленое окрашивание раствора.
Нормальные величины
Плазма крови до 1 месяца 75‑100 мкмоль/л
от 2 мес до 14 лет 25‑75 мкмоль/л
Моча до 1 года 6‑24 мкмоль/сут
до 14 лет 6‑72 мкмоль/сут
Практическое значение
Фенилкетонурия или фенилпировиноградная олигофрения (слабоумие) связана с врожденным отсутствием в печени фенилаланингидроксилазы, из-за чего нарушается превращение фенилаланина в тирозин, в крови и моче появляются фенилпируват и фенилаланин. Положительную реакцию Феллинга моча дает обычно после года жизни. До года тест бывает положительным эпизодически (на максимуме выведения фенилкетонов), поэтому при подозрении на фенилкетонурию его повторяют неоднократно. В крови повышается концентрация фенилаланина в десятки раз (до 600‑2400 мкмоль/л), в моче до 3‑12 мкмоль/сут. Фенилпируват появляется в моче также при поражениях печени (вирусный гепатит, отравление ядами).
Оформление работы
Указывают принцип метода, записывают результаты анализа, делают заключение о наличии/отсутствии патологии, отмечают практическую значимость.
Вопросы для самоконтроля
1) Транспорт аминокислот через клеточные мембраны.
2) Судьба всосавшихся в кровь аминокислот.
3) Основные реакции внутриклеточного обмена аминокислот (окислительное дезаминирование, трансаминирование, декарбоксилирование): механизм, ферменты и коферменты, продукты, значение.
4) Реакции образования биогенных аминов, биологическая роль, реакции инактивации, участие коферментов.
5) Особенности обмена отдельных аминокислот: глицина, серина, метионина, цистеина, фенилаланина, тирозина, триптофана, дикарбоновых аминокислот.
6) Основные пути возникновения патологий азотистого обмена.
ТЕМА 6.3.
Обезвреживание аммиака в организме
Актуальность
Аммиак является высокотоксичным веществом. При катаболизме аминокислот (70 г в сутки) и окислении биогенных аминов образуется большое количество NH3, но его уровень в крови не превышает 60 мкмоль/л (3 ммоль/л для кроликов ‑ летальная доза). Основной транспортной связанной формой аммиака служит глутамин, при повышении концентрации аммиака дополнительно активируется синтез аспарагина, в транспорте аминного азота мышц участвует аланин. NH3 связывается в тканях с образованием нетоксичных соединений, выделяемых с мочой ‑ мочевина, соли аммония, креатинин. Из состава транспортных форм NH3 может быть направлен на синтез азотистых оснований. Выделяется из организма в виде конечных продуктов их распада, в том числе — мочевой кислоты. В клинике часто выявляют нарушения процессов нейтрализации NH3.
Цель
1) Изучить основные формы транспорта аммиака, пути утилизации аммиака в реакциях обмена и пути обезвреживания аммиака с образованием и выведением конечных продуктов белкового обмена.
2) Научиться определять концентрацию мочевины в сыворотке крови и моче.
Вопросы для самоподготовки
1) Основные пути образования аммиака. Источники аммиака в тканях.
2) Токсичность аммиака, влияние на мозг, клеточное дыхание и торможение цикла трикарбоновых кислот. Влияние аммиака на организм при избыточном белковом питании.
3) Пути связывания аммиака в организме. Пути, нацеленные на прямую детоксикацию аммиака и выведение из организма конечных продуктов азотистого обмена. Пути, использующие аммиак для синтеза необходимых организму метаболитов с последующим выведением N-содержащих продуктов их распада.
4) Механизм синтеза глутамина — транспортной формы аммиака. Роль аланина в транспортировке аминного азота из работающих мышц в печень (аланиновый цикл).
5) Орнитиновый цикл мочевинообразования, связь с циклом Кребса.
6) Аммониогенез в почках.
7) Образование креатина и креатинина. Локализация, роль активной формы метионина. Значение креатинфосфокиназы и креатинфосфата для мышечной ткани.
8) Возможные механизмы нарушения образования конечных продуктов белкового обмена.
9) Клинико-диагностическое значение определения мочевины, креатинина в сыворотке крови и моче.
Лабораторная работа 1.
Определение содержания мочевины в сыворотке крови и моче
Диацетилмонооксимный метод
Принцип
Мочевина в кислой среде при нагревании образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиоссемикарбазида и солей железа комплекс красного (розово-красного) цвета. Интенсивность окраски пропорциональна уровню мочевины.
Реактивы
1) 10 % раствор трихлоруксусной кислоты, 2) рабочий раствор (смесь FeCl3, диацетилмонооксима, тиосемикарбазида, ортофосфорной кислоты и конц. H2SO4), 3) стандартный раствор мочевины (16,65 ммоль/л).
Материал для ис следования
Сыворотка крови, моча (разведение 1:50)
Проведение ан ализа
| Опыт 1, мл | Опыт 2, мл | Стандарт, мл | |
| Сыворотка Моча Стандарт мочевины Рабочий реактив | 0,01 ‑ ‑ 2,0 | ‑ 0,01 ‑ 2,0 | ‑ ‑ 0,01 2,0 |
| Перемешивают, закрывают фольгой. Инкубируют 20 мин в кипящей водяной бане, охлаждают под проточной водой. Не позже, чем через 15 мин, измеряют оптическую плотность проб против воды при длине волны 530‑560 нм (зеленый светофильтр) в кювете 1 см. | |||
Расчет
Мочевина сыворотки крови [ммоль/л] = 
Мочевина мочи [ммоль/л] = 
где: ЕОП ‑ оптическая плотность пробы, ЕСТ ‑ оптическая плотность стандарта, ССТ ‑ концентрация стандартного раствора, 50 ‑ разведение мочи.
Нормальные величины
Сыворотка 2,5‑8,3 ммоль/л
Моча 330‑580 ммоль/сут
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 136; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!