Темы для реферативных сообщений
1. Иммуноферментный анализ (ИФА), пути практического использования.
2. Полимеразная цепная реакция. Методы на основе ПЦР. Преимущества ПЦР‑диагностики.
3. Значение ИФА и ПЦР‑диагностики для выявления вирусных заболеваний, синдрома приобретенного иммунодефицита человека.
4. Нанотехнологии в клинической биохимии и создании современных лабораторных диагностикумов.
5. Нанотехнологии в выявлении антител к нормальным и патологическим липопротеинам при диагностике атеросклероза и ишемической болезни сердца.
6. РНК-зависимая ДНК_полимеразная активность. Теломераза.
7. Полноценное белковое питание и здоровье зубов и пародонта.
8. Характерные нарушения при белковом голодании и болезни «квашиоркор».
9. Основные нарушения обмена нуклеопротеинов.
10. Протеасомы и шапероны в жизни белка.
11. Использование генной инженерии и ДНК-технологий при синтезе лекарств.
Самостоятельная работа
Заполнить в таблице столбцы – «Транскрипция» и «Трансляция».
| Процесс | Репликация | Транскрипция | Трансляция |
| Субстраты | |||
| Источники энергии | |||
| Ферменты | |||
| Кофакторы | |||
| Направление синтеза новых цепей | |||
| Локализация процесса | |||
| Характеристика продукта |
Лабораторная работа 1.
Определение содержания общего белка в сыворотке крови
|
|
|
Концентрация общего белка в сыворотке крови ‑ величина достаточно стабильная. Увеличение содержания общего белка в крови называют гиперпротеинемией, снижение ‑ гипопротеинемией, однако чаще наблюдается дисбаланс в соотношении белков сыворотки при сохранении их общего количества ‑ диспротеинемия.
Изменения концентрации общего белка в сыворотке крови могут иметь абсолютный или относительный характер. Изменения абсолютного характера ‑ следствие колебаний содержания белка в крови. Относительные изменения показателя зависят от объема крови, то есть возникают при обезвоживании или гипергидратации организма.
Материал для исследования
Сыворотка крови.
Микробиуретовый метод
Принцип
Метод основан на способности белков и пептидов в щелочной среде формировать с медью комплекс фиолетовой или красно-фиолетовой окраски, интенсивность которой пропорциональна содержанию белка.
Реактивы
1) Биуретовый реактив (смесь сульфата меди (II) и натрия гидроксида),
2) эталонный раствор альбумина (70 г/л).
Проведение анализа
| Опыт, мл | Стандарт, мл | |||
| Сыворотка Раствор альбумина Биуретовый реактив | 0,04 ‑ 3,0 | ‑ 0,04 3,0 | ||
| Инкубируют 10 мин, измеряют оптическую плотность проб против дистиллированной воды в кювете 0,5 см, длина волны 540‑560 нм.
| ||||
Расчет
Расчет проводят по формуле:
Общий белок [г/л] = 
,
где ЕОП и ЕСТ ‑ оптическая плотность опытной и стандартной пробы,
ССТ ‑ концентрация белка в стандартной пробе.
Нормальные величины
Сыворотка крови 63‑85 г/л
Клинико-диагностическое значение
Изменения концентрации общего белка могут быть абсолютными и относительными. Изменения абсолютного характера ‑ следствие колебаний содержания белка в крови. Относительные изменения зависят от объема крови, то есть наблюдаются при обезвоживании или гипергидратации.
Гипопротеинемия чаще всего связана с уменьшением фракции альбуминов. Истинная (абсолютная) гипопротеинемия связана: а) с недостаточным потреблением белка с пищей ‑ заболевания желудочно-кишечного тракта, сужение пищевода при опухолях, недоедание, голодание; б) со снижением синтеза белка ‑ несбалансированный состав белков пищи, хронические паренхиматозные гепатиты, интоксикации, злокачественные новообразования, лечение кортикостероидами; в) с усиленным распадом белка ‑ кахексия, тяжелые инфекции, длительные воспалительные процессы, лихорадочные состояния, тиреотоксикоз), г) с потерей белка ‑ нарушения проницаемости капилляров, кровоизлияния, ожоги, острые и хронические кровотечения. Относительная гипопротеинемия: гипергидратация – нарушении водного баланса. Истинная гиперпротеинемия: при острых инфекциях (увеличение синтеза белков острой фазы), при хронических процессах (активация иммунной системы и возникновение g‑глобулинемии) – миеломной болезни, лимфогрануломатозе, саркоидозе. Относительная гиперпротеинемия: при потерях внутрисосудистой жидкости при профузных поносах (холера и др.), усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, несахарном диабете, тяжелых и обширных ожогах, генерализованных перитонитах.
|
|
|
Оформление работы
Указывают принцип метода, регистрируют показания приборов, делают расчеты. Сравнивают полученные данные с нормальными величинами, делают вывод по возможным заболеваниям.
Лабораторная работа 2.
Современные методы оценки экспрессии генов (теоретически)
В современном мире интенсивно развиваются ДНК‑технологии (наиболее известен ПЦР-анализ) и иммунобиохимические методы, используемые при изучении фундаментальных проблем протеомики, метаболомики, иммунологии, эндокринологии, генетики и при решении практических задач медицины, требующих точной оценки экспрессии белков, содержания биологически активных веществ или идентификации возбудителя заболевания.
|
|
|
Использование современных методов требует наличия в лабораториях специальной аппаратуры и строгого соблюдения технологических процессов, что не всегда возможно воспроизвести в условиях учебных аудиторий. Однако базовые знания передовых биомедицинских технологий необходимы современному специалисту, поэтому на практических занятиях предоставлена возможность ознакомиться с общими основами наиболее актуальных методов. К наиболее востребованным относится иммуноферментный анализ (ИФА) – это одновременно фотоколориметрический и иммунохимический метод. Использование ИФА-тест-систем в практическом здравоохранении способствует разностороннему системному подходу к обследованию пациента на этапах установления диагноза, уточнения молекулярных механизмов и динамики заболевания, проверки эффективности лечения, в том числе при патологии соединительной и костной тканей, широко представленных в полости рта.
Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (англ. – Enzyme Immuno Assay (EIA), Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay (ELISA)) чаще всего применяют в диагностических целях для идентификации специфических белковых молекул или их фрагментов, характерных для определённой патологии, для оценки наличия в крови специфических антител к возбудителю подозреваемой патологии. Разработаны варианты анализа, основанные на выявлении, как антигенов, так и антител. Чувствительность метода ИФА имеет ограничения.
Этапы проведения анализа
1 этап. Для анализа используют специальные планшеты из полистирола, с круглыми плоскодонными лунками, вместимостью около 300 мкл. На планшете 96 лунок (8 рядов по 12 лунок). Перед анализом планшету сенсибилизируют, нанося раствор антигена. Обычно это не целая структура возбудителя, а часть (наиболее характерная) белков его оболочки. Антигены для ИФА часто получают генноинженерными технологиями на трансгенных E.Coli. Растворимые антигены из раствора закрепляются на поверхности планшеты путём специфических взаимодействий. Затем для снижения помех участки незанятой антигеном поверхности «укрывают» нанесением раствора бычьего сыровоточного альбумина. Несвязанный материал удаляют, планшету сушат. Сенсибилизированные планшеты можно хранить не более 2 недель при ‑18º С.
2 этап. При выполнении анализа лунки заполняют исследуемым материалом (сыворотка крови), нанося его в разные лунки с дробным разбавлением (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и т.д.), затем выдерживают около 30 мин для связывания. Если в образцах имеются антитела, комплементарные нанесенному антигену, они образуют с ним прочные комплексы. После удаления образцов лунки трехкратно промывают буфером для удаления остатков несвязавшегося материала.
3 этап. Далее лунки заполняют раствором конъюгата, представляющего собой молекулы белка-фермента (чаще всего пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) связанные посредством глутарового альдегида с молекулами вторичных антител (это антитела против антител к возбудителю, их получают из сыворотки кролика или другого вида животных при введении в его кровь антител человека к искомому возбудителю). Молекулы конъюгата соединяются в лунке с осадившимися на антигене молекулами антител из испытуемого образца. На прохождение реакции комплементарного связывания дают определённое время, после чего избыток раствора конъюгата удаляют и лунки промывают буфером.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 114; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!