Схема гибридизации ДНК с праймерами
2) Гибридизация ДНК с праймерами ‑ отжиг праймеров с комплементарными последовательностями. Специфическая гибридизация цепей ДНК с праймерами протекает при 30‑60°С. При амплификации с помощью ПЦР используют 2 олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующих участок ДНК, специфичный для определяемого возбудителя. Искусственно синтезированные для ПЦР праймеры представляют собой олигодезоксирибонуклеотиды (длиной около 20‑30 остатков нуклеотидов). Для синтеза праймеров необходимо знать первичную структуру (последовательность нуклеотидов) амплифицируемой области ДНК. Праймеры должны быть комплементарны 3'-концам амплифицируемого участка.
3)Элонгация (полимеризация) ДНК ‑ этап достройки полинуклеотидных цепей, начиная от праймеров, с помощью ДНК-полимеразы (60‑75°С). Праймеры ориентированы так, что полимераза ведёт синтез только между ними, удваивая копии этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют «ампликон». Количество специфического фрагмента растёт по экспоненте согласно формуле ~2n (n ‑ число циклов амплификации). Один цикл идет менее 3 мин. За 2 ч можно получить около 109 копий определяемого участка ДНК. Амплификация эффективна при использовании термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы), выделенной из Thermus Aquaticus – бактерий горячих источников (оптимум реакции 70‑75°С), которую не нужно заменять после каждого цикла. Такой 3-ступенчатый цикл повторяется, пока не синтезируется достаточно материала для детекции.
|
|
|
Детекция (регистрация) результатов может идти одним из двух путей.
1) Электрофорез с последующим флюоресцентным анализом комплексов «копии ДНК‑метка», для чего нужны источник тока и камера для электрофореза, источник ультрафиолетового излучения (транслюминатор) для создания светового потока в области ультафиолетового спектра при анализе агарозных гелей. Для электрофореза используют агарозный или полиакриламидный гель с этидия бромидом, образущим комплексы с ДНК, флюоресцирующие в ультрафиолетовых лучах. Удаётся разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся только на 1 нуклеотид.
2) Колориметрическое определение продуктов работы белкового комплекса, связавшегося с копиями ДНК, для чего нужен много- или одноканальный фотометр для плашек и промватель для них. В плашке на дне лунок к поверхности фиксирован белок ВSA, способный связывать копии нитей ДНК. После инкубации неиспользованные компоненты удаляют промыванием. Для количественной оценки результатов реакции добавляют комплекс белка авидина с ферментом, связывающийся в лунке, непрореагировавшие компоненты отмывают и добавляют субстраты для фермента. Фермент преобразует субстраты в цветные продукты, интенсивность окраски регистрируют фотометрически.
|
|
|
Вопросы для самоконтроля
1) Общие принципы, этапы и механизмы матричных биосинтезов нуклеиновых кислот, ключевые ферменты процессов.
2) Этапы биосинтеза белка (транскрипция, рекогниция, трансляция).
3) Транскрипция и созревание различных видов РНК (сплайсинг и др.), ферменты и рибозимы. Этапы и механизмы активации аминокислот, ферменты и т-РНК, соотношение компонентов.
4) Этапы трансляции, характеристика участников, факторы регуляции, механизм образования пептидной связи на рибосомах. Значение нематричного синтеза пептидной связи.
5) Регуляция биосинтеза белка. Lac-оперон, триптофановый оперон.
6) ИФА и ПЦР-анализ, методология и клинико-диагностическое значение.
7) Генно-инженерные пути синтеза белковых препаратов.
8) Влияние лекарственных препаратов на различные этапы биосинтеза белка.
Тестовые задания
Выбрать один правильный ответ.
1. Донором углерода в синтезе пуриновых нуклеотидов является
1) аспарагиновая кислота
2) формил-ТГФК
3) глутамин
4) триптофан
2. Регуляторным ферментом синтеза пиримидиновых нуклеотидов является
|
|
|
1) ксантиноксидаза
2) карбамоилфосфатсинтетаза II
3) дигидрооротаза
4) карбамоилфосфатсинтетаза I
3. Причиной эффективности аллопуринола при лечении подагры является
1) конкурентное ингибиторование ксантиноксидазы
2) понижение концентрации гипоксантина в моче
3) увеличение скорости выведения мочевой кислоты почками
4) уменьшение скорости образования пуриновых оснований
4. К развитию оротацидурии приводит дефект фермента
1) карбамоилфосфатсинтетаза I
2) карбамоилфосфатсинтетаза II
3) ксантиноксидаза
4) ОМФ-декарбоксилаза
5. Конечным продуктом распада пуриновых нуклеотидов является
1) мочевина
2) мочевая кислота
3) молочная кислота
4) малоновая кислота
6. Правильно характеризует свойства биологического кода положение –
1) каждому кодону соответствует до трех аминокислот
2) одну аминокислоту могут кодировать несколько триплетов
3) каждой аминокислоте соответствует только один кодон
4) кодоны м-РНК считываются в направлении от 3` к 5` концу
7. Для процесса транскрипции матрицей является
1) ДНК
2) мРНК
3) тРНК
4) рРНК
8. Для реакций трансляции необходимо наличие
1) лизосом
2) РНК-полимеразы
3) м-РНК
4) АТФ
9. Для образования пептидных связей в процессе синтеза белка необходима
|
|
|
1) аминоацил-т-РНК синтетаза
2) пептидилтрансфераза
3) транслоказа
4) карбоксипептидаза
10. Различия фенотипа органов и тканей многоклеточных обусловлены
1) стойкой репрессией отдельных генов
2) аллостерическим ингибированием различных ферментов
3) различиями в наборе ДНК
4) различиями в посттрансляционной модификации белков
Ситуационные задачи
1. Ребенок в возрасте 1 года поступил в детскую больницу с явлениями отсталости физического и умственного развития. При исследовании мочи выявлена высокая концентрация мочевой кислоты. Пояснить причину ее появления.
2. При недостатке в рационе фолиевой кислоты развиваются мегалобластическая анемия и лейкопения, нарушается состояние слизистых оболочек и кожи. Пояснить биохимическую причину таких нарушений.
3. В кодоне 5'-ГАА-3' информационной РНК, ответственной за синтез b‑полипептидной цепи гемоглобина, обнаружено замещение последнего аденилового нуклеотида на уридиловый. Указать, результатом чего стала такая замена. Пояснить, к каким метаболическим последствиям и к какому заболеванию она приводит и почему.
4. Противоопухолевый препарат цисплатин является ингибитором ферментов топоизомераз. Пояснить, каким образом ингибирование влияет на опухолевые клетки.
ТЕМА
"Обмен белков и нуклеиновых кислот.
Матричные биосинтезы"
(контрольное занятие по разделам 6 и 7)
Вопросы для самоподготовки
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 249; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!