Схема процедуры проведения иммуноферментного анализа
4 этап. Лунки заполняют раствором субстрата, который в течение 1 ч превращается в окрашенный продукт под действием конъюгированного фермента. Реакцию останавливают добавлением кислоты. Чувствительность ИФА высока благодаря «усилению сигнала» на конъюгированном ферменте. Каждая молекула исследуемого антитела связывает 1 молекулу фермента, катализирующую превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата в цветной продукт. Субстратом для конъюгатов, связанных с пероксидазой хрена, является орто-фенилендиамин в смеси с Н2О2, что даёт оранжево-коричневые растворы, поглощающие свет при 492 нм. Субстрат щелочной фосфатазы – пара-нитрофенилфосфат – преобразуется в пара‑нитрофенол, поглощающий свет при 405 нм.
5 этап. На специальном планшетном фотометре через дно просвечивают каждую лунку. По оптической плотности окраски судят о концентрации антител в исследуемой сыворотке. Количество превращённого субстрата пропорционально концентрации конъюгата и, следовательно, концентрации антител против возбудителя в исследуемом образце. В «холостых» контрольных лунках параллельно основному анализу проводят реакцию для установления порога «шумов», а для проверки специфичности реакции с антителами имеются лунки, заполненные антителами из контрольного раствора.
В ряде случаев, чтобы подтвердить отсутствие антител, наряду с процедурой ИФА требуется проведение ПЦР-анализа (см. ниже по тексту), например, донорскую кровь оценивают на наличие вируса СПИД, возбудителей ряда других заболеваний. Дело в том, что в первые дни после заражения число антител к патогену в крови может оказаться настолько малым, что иммуноферментный анализ часто даёт так называемую «серонегативную реакцию», то есть не индентифицирует специфические антитела при имеющемся возбудителе.
|
|
|
Иммунофлуоресцентное и иммунохимическое исследования
Иммунофлуоресцентный анализ или тест на флуоресцирующие антитела (Immunofluorescence Assay (IFA), Fluorescent Antibody Test (FAT)) – одна из наиболее простых диагностических процедур.
Этапы проведения анализа
На плёнку наносят исследуемый образец (сыворотку или плазму крови и др.), который содержит или не содержит искомые антигены (специфические белки, антигены возбудителя подозреваемой патологии и др.).
Схема проведения иммунофлюоресцентного анализа
Для выявления антигенов на ту же плёнку наносят раствор антител к этому антигену, конъюгированных (т.е. связанных ковалентно) с молекулами флуоресцирующего соединения, которое выступает в роли маркёра, удобного для обнаружения.
Плёнку выдерживают в растворе антител некоторое время, достаточное для связывания антител с антигенами (если таковые имелись в исследуемом образце), после чего избыток несвязавшихся антител смывают буфером, а плёнку рассматривают на флуоресцентном микроскопе. Если в образце присутствовал антиген патологии, то с ним будут прочно связаны молекулы меченых флуоресцеином антител, под микроскопом можно наблюдать зелёное окрашивание.
|
|
|
Иммуногистохимические исследования похожи на иммунофлуоресцентный анализ. Главное отличие метода состоит в наличии биохимической составляющей вместо флюоресцентной метки. Кроме диагностики клеток крови, такие исследования полезны при оценке срезов тканей, культур клеток.
Особенности проведения анализа
Контрольные антитела к антигену выявляемой патологии в случаяе иммунохимического анализа конъюгированы не с флуоресцентным маркером, а с белком‑ферментом (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза). После сорбции меченых антител на возможных молекулах антигена в составе биообъекта добавляют раствора субстрата для ферментативной реакции. Единственная молекула белка‑фермента катализирует превращение десятков и сотен тысяч молекул неокрашенного субстрата в окрашенные продукты, усиливая «сигнал» и повышая чувствительность анализа. После остановки реакции появляются цветные окрашенные полосы в местах нахождения антигена.
|
|
|
3) ДНК‑диагностика заболеваний
Достижения в области биохимии и молекулярной биологии меняют возможности коррекции различных патологических процессов. Доказана взаимосвязь между изменениями структуры ДНК и рядом заболеваний. Идентификация генов, нарушение работы которых приводит к развитию наследственных заболеваний, создала предпосылки для развития эффективных методов их коррекции, лечения и профилактики. На основе представлений об экспрессии генов, реализуемой в виде белкового продукта, разработаны новые способы диагностики и лечения заболеваний. С помощью генной терапии оказалось возможным встраивать полноценно работающие гены в клетки организма и восстанавливать метаболические нарушения, вызванные мутантными генами. Для выявления дефектов в структуре ДНК, ее нужно выделить (сначала из биологической жидкости, биоптата или культуры клеток, затем непосредственно из структуры клеток) и «наработать» в таком количестве, которого будет достаточно для лабораторного исследования. При использовании с целью терапии гены должны быть выделены для введения их в дефектные клетки организма. Основные методы, используемые в ДНК-диагностике заболеваний: выделение ДНК, расщепление ДНК, идентификация специфических последовательностей ДНК, блот-гибридизация ДНК, секвенирование ДНК (установление первичной структуры фрагментов), получение рекомбинантных ДНК и их амплификация.
|
|
|
Полимеразная цепная реакция и ПЦР‑исследования
(Polymerase Chain Reaction, PCR‑Assay) основаны на анализе нуклеиновых кислот и не зависят от свойств белков. Методология ПЦР позволяет проводить исследования очень точно и с высокой чувствительностью. С помощью ПЦР одну молекулу идентифицируемой ДНК можно обнаружить в присутствии миллионов других молекул ДНК. Суть ПЦР-исследований заключается в идентификации специфического участка молекулы ДНК и копировании (амплификации in vitro) его с целью получения достаточного количества копий, которые можно выявить доступными методами детекции. Метод ПЦР позволяет избирательно синтезировать участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК. За несколько часов можно выделить и размножить последовательность ДНК в количествах, превышающих исходные в 108 раз.
Необходимое оборудование
При ПЦР‑диагностике для выделения образца ДНК или РНК используют микроцентрифугу (13000‑16000 об/мин), встряхиватель типа «вортекс» и термоблок до 100°С. Для амплификации (умножения) детектируемого участка генома выделенные образцы помещают в программируемый термостат (термоциклер или амплификатор), где можно задавать температурный режим (90‑95°С, 30‑50°С, 60‑70°С), параметры времени, количество циклов. Прибор рассчитан на одновременный анализ 24‑96 образцов клинического материала, из которых один положительный и один отрицательный контроль. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка. Для ПЦР-диагностики необходимы: исследуемая ДНК, субстраты синтеза (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ), два праймера, термофильная ДНК‑полимераза, ионы Mg2+.
Этапы проведения анализа
Амплификация заключается в повторении циклов, представляющих собой трехступенчатый процесс, протекающий при разных температурах.
1) Денатурация ДНК (90‑95°С) ‑ разрыв слабых связей между основаниями матричной молекулы ДНК с образованием 1‑цепочечных молекул.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 162; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!