Схема лабораторной диагностики ВГС
1. Первичное массовое обследование на ВГС — определение методом ИФА в сыворотке крови антител к вирусу класса IgG.
2. Определение спектра антител к отдельным протеинам ВГС.
3. Обнаружение в крови РНК ВГС, определение генотипа вируса и вирусной нагрузки.
Антитела к вирусу (anti-HCV tot)
Anti-HCV tot свидетельствуют о контакте пациента с вирусом и обнаруживаются как при остром, так и при хроническом гепатите. В большинстве случаев их наличие совпадает с присутствием в крови РНК HCV. Существует несколько поколений диагностических тест-систем для выявления anti-HCV tot, отличающихся своей чувствительностью и специфичностью (таблица 4).
Таблица 4. Сравнение разных поколений диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВГС.
| Тест-система | Шифр фрагментов | Белок, содержащий данный фрагмент | Эффектив-ность | Время выявления антител от начала желтухи |
| 1 поколение | С100-3 | NS3 и NS4 | до 82,2% | 30-90 дней |
| 2 поколение | С100-3, С22, С33с | cor, NS3, NS4 | до 97,5% | 20-25 дней |
| 3 поколение | С100-3, С22, С33с, NS5 | cor, NS3, NS4, NS5 | до 99,7% | 7-10 дней |
| 4 поколение* | С100-3, С22, С33с, NS5 | cor, NS3, NS4, NS5 | до 99,7% | 7-10 дней |
| RIBA-3 | С100-3, С22, С33с, NS5, e1, e2 | cor, NS3, NS4, NS5, E1, E2 | до 99,6% | до 7 дней |
*Тест-системы 4-го поколения содержат синтетические и рекомбинантные вирусные антигены, размеры которых могут отличаться от фрагментов 3-го поколения.
Наиболее совершенны тест-системы 3-го и 4-го поколения, использующиеся в клинической практике начиная с 1995 года. Тест-системы 3-го и 4-го поколения позволяют выявить anti-HCV в 99,7% случаев. В некоторых случаях антитела к HCV могут не обнаруживаться, например, при запаздывании иммунного ответа, применении иммуносупрессивной терапии или иммуносупрессии на фоне онкологического заболевания, приема наркотических веществ и т.д. Очень редко наблюдаются ложноположительные результаты. Современные методы серодиагностики являются достаточно чувствительными и информативными, а их внедрение в практику повысило частоту выявления лиц, инфицированных ВГС. Однако наличие суммарных антител к HCV лишь констатирует факт контакта пациента с ВГС, но не позволяет судить ни об инфицированности, ни о репликации вируса, ни, тем более, о давности процесса либо его завершенности.
|
|
|
Поэтому положительный результат исследования обязательно должен быть проверен путем перестановки анализа в двух параллельных пробах. Если хотя бы одна из двух проб данной сыворотки при этом снова дает положительный результат, образец считают первично положительным и исследуют в подтверждающей ИФА тест-системе Анти-HCV СПЕКТР или на основе иммуноблота RIBA HCV SIA. Подтверждающая тест-система Анти-HCV СПЕКТР позволяет выявить антитела к нанесенным отдельно белкам вируса – corе, NS3, NS4, NS5.
|
|
|
При остром ВГС из антител первыми появляются анти-HCV core, сначала IgM и вскоре IgG. Это происходит большей частью спустя 15–20 недель после заражения. Появление антител к неструктурным белкам вируса NS4 и NS5 может свидетельствовать о хронизации процесса.
При благоприятном исходе острого ГС с выздоровлением анти-HCV core IgM исчезают в ранние сроки (до двух месяцев), а анти-HCV core IgG продолжают циркулировать в крови в течение 1–4, реже 10–15 лет. Это учитывается при установлении HCV-пастинфекции. Но наличие данных антител не предотвращает от повторного инфицирования ВГС.
Истинных реконвалесцентов после острого ГС не много, 15–20%. У значительной части больных острая фаза сменяется латентной с постепенным формированием хронического гепатита. При хроническом гепатите в крови закономерно обнаруживаются анти-HCV IgG ко всем протеинам вируса – corе, NS3, NS4, NS5.
В службе крови всех стран тестирование донорской крови на наличие anti-HCV является обязательным. Выявление anti-HCV в пробе крови является бесспорным основанием для ее выбраковки. Необходимо иметь в виду, что вполне реально столкнуться с ложноотрицательными результатами диагностики вирусного гепатита С (на ранней стадии заболевания, когда антител еще нет). В 1999 году компаний США и Японии начали производство иммуноферментных тест-систем для выявления антигена вируса гепатита С. Такие диагностические наборы позволяют выявлять инфицированных доноров за несколько недель до появления в их крови антител к вирусу, т.е. в «серонегативный» период. Но метод анализа антигена HCV недостаточно чувствителен (1–2 пг/мл) и не позволяет выявить низкую репликацию вируса (ниже 10000–20000 МЕ/мл).
|
|
|
РНК вируса (HCV RNA)
РНК HCV обнаруживается методом полимеразной цепной реакции в сыворотке/плазме крови, лейкоцитах и пункционных биоптатах печени.
Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является золотым стандартом диагностики, характеризующим виремию, свидетельствующую о продолжающейся активной репликации HCV в гепатоцитах. Выявление вирусной РНК всегда указывает на текущую инфекцию. Однако существуют случаи, когда:
· на фоне высокого уровня противовирусных антител при остром гепатите С вирусная РНК может не выявляться, что не гарантирует ни ее появления в дальнейшем, ни перехода гепатита в хроническую форму;
|
|
|
· при хроническом гепатите С виремия может быть преходящей, в связи с этим вирусная РНК обнаруживается непостоянно;
· после перенесенной инфекции РНК может не выявляться, а противовирусные антитела продолжают определяться, в таком случае выздоровление должно быть подтверждено многократным отрицательным результатом определения вирусной РНК.
Выявление РНК HCV является основанием диагноза гепатита С в случаях серонегативности, например, на ранней стадии инфекции (РНК HCV обнаруживается в сыворотке крови уже в течение первой недели после инфицирования) а также у пациентов с иммунодепрессией, у которых антителогенез подавлен. Качественный ПЦР-анализ на РНК ВГС необходим также для мониторинга противовирусной терапии, так как исчезновение вирусной РНК в процессе лечения является одним из критериев его эффективности.
Количественное определение РНК HCV (вирусной нагрузки) необходимо для выбора схемы противовирусной терапии, прогноза и мониторинга ее эффективности.
Факты в пользу определения вирусной нагрузки HCV:
1. Концентрация вируса в крови влияет на тактику лечения. Высокие показатели вирусной нагрузки (более 2 000 000 копий РНК/мл или приблизительно 500 000 МЕ/мл) являются показателем неблагоприятного прогноза в отношении эффективности терапии. Поэтому пациентам с высокой вирусной нагрузкой рекомендуется назначение комбинированной и продолжительной противовирусной терапии.
2. Виремия может быть преходящая или стабильно низкая, поэтому необходим более чувствительный метод. Порог чувствительности количественной ПЦР в 10 раз выше, чем порог чувствительности качественной ПЦР.
3. Уровень виремии служит не только важным прогностическим признаком эффективности лечения, поэтому точное определение исходной концентрации вирусной РНК имеет исключительно большое значение:
· гепатит считается излеченным, если достигается устойчивый вирусологический ответ, то есть через 12 месяцев после завершения противовирусной терапии тест на вирусную РНК остается отрицательным;
· предвестником излечения служит ранний вирусологический ответ — уменьшение концентрации вирусной РНК не меньше чем в 100 раз или исчезновение вируса из крови в первые 12 недель лечения;
· если отрицательный результат теста на вирусную РНК зафиксирован по завершении терапии, говорят об ответе в конце лечения;
· когда вирусная РНК вновь появляется после отмены препаратов, считается, что у больного рецидив;
· если в ходе лечения концентрация вируса гепатита C остается неизменной, это свидетельствует об отсутствии ответа на лечение; если виремия снижается (например, более чем в 100 раз), но вирус продолжает определяться в крови — о частичном ответе на лечение.
В настоящее время широко применяются два вида тестов для определения вирусной нагрузки. Оба метода направлены на обнаружение РНК вируса гепатита С.
1. Количественная ПЦР (Q-PCR, Real-time PCR). Этот тест является очень чувствительным, позволяет определять вирусную нагрузку до 50 МЕ/мл. Метод основан на измерении РНК посредством флюоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Измерение количества РНК проводится в специальных приборах (Real-time машины). Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР на момент измерения. С помощью специального программного обеспечения, основываясь на данных, собранных за 40–45 циклов ПЦР, прибор просчитывает концентрацию РНК в миллилитрах.
2. Метод разветвленной ДНК (b-DNA). Чувствительность данного метода значительно ниже, сравнима с качественной ПЦР, позволяет измерять вирусную нагрузку порядка 500 МЕ/мл.
Вирусная нагрузка бывает высокой и низкой и в целях стандартизации выражается в Международных единицах на мл (МЕ/мл):
· высокая — более 500 000 МЕ/мл
· низкая — менее 500 000 МЕ/мл.
Информацию для пересчета из МЕ/мл в копии/мл (или наоборот) предоставляет тестирующая лаборатория, так как стандартной формулы не существует. Уровни РНК HCV при хронической инфекции весьма вариабельны и варьируют от 5000 до 25 000 000 МЕ/мл. Однако у конкретного пациента уровни РНК HCV относительно стабильны. При низкой репликации определить концентрацию вирусной РНК иногда не удается (если вирусная нагрузка находится ниже порогового уровня, который составляет 10–50 МЕ/мл).
Методом ПЦР возможно также определение генотипов ВГС: 1а, 1b, 1с, 2а, 2b, 2с, 3а, что необходимо для выбора схем противовирусной терапии. При инфицировании 2 либо 3 генотипом вируса доза препарата ниже и продолжительность лечения может быть меньше, чем при 1 генотипе. При 1b генотипе рекомендуется комбинированная противовирусная терапия двумя препаратами. При инфицировании более чем одним генотипом вируса ответ на лечение и течение болезни будет иным, чем при инфицировании одним генотипом.
Причины ложных реакций при определении РНК HCV в ПЦР
Ложноотрицательные реакции:
· потеря или разрушение РНК HCV в ходе подготовки к реакции клинического материала;
· наличие в образце ингибиторов ПЦР;
· некомплементарность праймера с матрицей генома вследствие вариабельности РНК HCV;
· несоблюдение режима хранения и транспортировки клинического материала.
Ложноположительные реакции:
· контаминация материала продуктами амплификации;
· загрязнение отдельных образцов при проведении реакции.
Рис. 6. Примерный серологический профиль, характерный
Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 88; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!