Опыт №1. Мезентериальная лимфаденэктомия.
В экспериментальной медицине лимфаденэктомия является быстрым и надежным способом исследования состояния лимфатических узлов организма и получения клеток-эффекторов иммунной системы. В клинике элиминация отдельных лимфоузлов и/или регионарных групп лимфоузлов – необходимый компонент оперативного лечения ряда онкологических, хирургических и других заболеваний.
Крыса вводится в наркоз парами эфира и фиксируется на препаровальном (операционно) столике в положении «на спине». Сбривают с брюшной поверхности животного шесть и смазывают кожу 70% р-ром этилового спирта или иным противобактериальным средством. Производят послойный срединный разрез передней брюшной стенки и находят участок кишечника, где тонкая кишка переходит в толстую. Выводят этот участок кишечника наружу на стерильную салфетку.
Пинцетом и/или зажимом захватывают участок брыжейки с лимфатическими узлами, осторожно выделяют их из жировой клетчатки, иссекают и удаляют единым комплексом и помещают в готовую среду для фиксации операционного материала (например, нейтральный забуференный формалин).
Укладывают участок кишечника на место и послойно ушивают операционную рану. Животное снимается с препаровального столика и осторожно укладывается в боковом положении в индивидуальную клетку. Длительность индивидуального содержания зависит от объема взятой крови и колеблется от 1 до 3 суток. Лимфообращение восстанавливается за 1,5 – 2 месяца.
|
|
|
Демонстрация учебного видеофильма «Современные методы иммунологической диагностики в клинических и экспериментальных исследований (ИФА и ПЦМ)
Демонстрация учебного фильма кафедры патологической физиологии ГОУ ВПО СПбГПМА, посвященного рассмотрению основных методов современной иммунологической диагностики.
Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA ) – высокочувствительный метод иммунологической диагностики количественного/качественного определения различных антигенных детерминант в анализируемом материале (чаще – кровь пациента).
Проточная иммуноцитометрия – комплексный метод иммунологической диагностики, основанный на оптическом анализе структурных и функциональных изменений в клетке. Позволяет с высокой точностью производить фенотипирование клеток, анализ клеточного цикла, активности протеинов и т.п.
Список литературы
1. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. – М.: Мир, 1990. – 395 с.
2. Ройт А, Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. - М.: Мир, 2000. – 592 с.
3. Васильев А.Г., Чурилов Л.П. Иммунология и иммунопатология. - Санкт-Петербург, Сотис, 2006. – 180с.
ПАТОФИЗИОЛОГИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА
|
|
|
Опухолевый рост – патологический процесс разрастания ткани, состоящей из клеток с высокой пролиферативной активностью, с нарушенными контролем клеточного цикла и морфофизиологической дифференцировкой и со способностью ускользать от надзора эффекторов иммунной системы и ингибирующих сигналов организма. Неопластические (злокачественные) клетки способны продолжать развитие не только в пределах исходной ткани в рамках привычного им окружения, но и в других тканях, что обусловливает инвазивный рост и метастазирование опухолей [1 – 2].
В процессе становления онкологии представления об этиологии и механизмах неопластического процесса претерпели значительные изменения. В историческом плане основными теоретическими концепциями опухолевого роста явились работы, посвященные роли механического раздражения и воспаления (R. Virchow, 1867), теория зародышевых листков, объясняющая развитие новообразований из «неиспользованных» в онтогенезе эмбриональных зачатков (J. F. Cohnheim, 1877), дисметаболическая теория, химическая и вирусная теории канцерогенеза, и, наконец, полиэтиологическая и молекулярно-генетическая теория. Несмотря на очевидный прогресс в развитии фундаментальной и клинической онкологии, окончательно представления о механизмах канцерогенеза не сформированы.
|
|
|
Современная онкогенная теория окончательно сформировалась в 80-е годы ХХ века. В ее основе лежит представление о структурно-функциональных нарушениях работы протоонкогена (онкогена), выходе его активности из под супрессорного действия антионкогенов организма.
Протоонкогены – гены, непременно имеющиеся у любых клеток, в физиологических условиях стимулирующие продукцию ростовых факторов, рецепторов для них и пострецепторных факторов (в т.ч. на уровне транскрипции), и (или) блокирующих или ингибирующих апоптоз. В норме они находятся под регулирующим влиянием организма. Разблокирование (спонтанное или под воздействием канцерогенов) протоонкогена выводит его активность из под контроля внешних регуляторных систем и способно привести к опухолевой трансформации клетки [3].
Чрезвычайно важно, что одномоментного действия канцерогенов для запуска механизмов опухолевой трансформации недостаточно: для начала и развития опухолевого роста необходимо также воздействие на опухолевую клетку промотирующих факторов и недостаточная работа иммунной системы по обнаружению и уничтожению таких клеток. В качестве этих агентов могут выступать факторы роста, например: фосфолипаза-Сg, ser-tre-P-киназа, Raf-1, МАПК-энзимы, G-белки и другие ГТФ-связ. белки,
циклины и т.д.
|
|
|
Наибольший удельный вес в механизмах опухолевой трансформации (а также, в дальнейшем, озлокачествления, малигнизации) имеют хромосомные аберрации и, особенно, транслокации. Ускорению мутационного процесса способствует приобретение клеткой т.н. геномной нестабильности – склонности к повышенному появлению и наследственному закреплению мутаций. Как правило, мутация одного протонкогена редко приводит к малигнизации, для этого необходимо несколько мутаций (от 5 – 9) в различных прото- и антионкогенах.
Антионкогены – гены, обеспечивающие подавляющее действие на пролиферативные процессы в клетке и активирующие механизмы апоптоза. Предполагается, что мутации антионкогенов при опухолевой трансформации происходят чаще, чем мутации протоонкогенов.
Согласно эпигенетической теории опухолевого роста, злокачественные новообразования являются результатом не столько непосредственного повреждения генетического аппарата клетки, сколько изменением работы генов, в том числе за счет нарушения метилирования ДНК. Метилирование ДНК – процесс присоединения метильной группировки к цитозину CpG-динуклеотида при участии ДНК-метилтранферазы, является одним из механизмов контроля экспрессии генов, «выключая» гены расположенные рядом с зоной метилирования. Дисбалансирование метилирования способно многократно усилить мутационные процессы в клетке, изменяя структуру и функции ДНК и, как следствие, повышая уровень экспрессии онкогенов [5].
В целом в опухолевой ткани процессы метилирования значительно снижены, но отмечаются локальные области гиперметилирования – с формированием так называемых «горячих точек» прогрессии опухолей.
Опухолевая трансформация – процесс приобретения клеткой неопластических свойств:
1. Возникновение геномной нестабильности – процесса дестабилизации генетического аппарата клетки с увеличением вероятности возникновения спонтанных мутаций. Механизмы генетической нестабильности лежат в основе возникновения субклонов опухоли и их обособления, т.е. опухолевой прогрессии;
2. Относительная автономность от регулирующего влияния организма, активирующего или ингибирующего механизмы пролиферации и иную функциональную активность клетки;
3. Способность ингибировать процессы апоптоза;
4. Способность изменять активность клеток-эффекторов иммунной системы, блокировать их работу и ускользать от воздействия гуморальных факторов иммунитета;
5. Нарушение механизмов морфофизиологической и биохимической дифференцировки клеток и механизмов их взаимодействия с «микроокружением» - соседними клетками и интерстициальным матриксом;
6. Иммортализация, т.е. отсутствие репликативного старения (преодоление числа Хейфлика (L. Hayflick, 1965)), вследствие повышенной экспрессии теломеразы – фермента, обеспечивающего отсутствие сокращения числа теломер при клеточном делении. Иммортализация усиливает механизмы избегания неопластической клеткой ограничивающих пролиферацию влияний организма;
7. Способность стимулировать процессы неоангиогенеза – формирование сети кровеносных сосудов, питающих опухоль, из близлежащих капилляров. Неоангиогенез необходим для развития опухолевого узла вследствие ограничений накладываемых законами диффузии; рассчитано, что без инициации прорастания кровеносных сосудов в формирующуюся опухоль, последняя не сможет достичь размеров превышающих 2 – 3 мм в диаметре. В ходе клинических наблюдений и экспериментальных исследований наблюдается увеличение плотности сосудистого русла в области опухоли. Для опухолей показано наличие прямой корреляции между степенью васкуляризации первичного очага и скоростью роста и метастатической активностью новообразования, что позволяет рассматривать процесс ангиогенеза к качестве подготовительного этапа метастазирования опухолей. Установлено, что степень развития микрососудов в зоне роста новообразования зависит от его стадии, при этом прогноз течения заболевания у пациентов с выраженным опухольиндуцированным ангиогенезом значительно хуже по сравнению с пациентами у которых васкуляризация опухоли слабее развита. Регуляция неоангиогенеза путем элиминации и/или блокирования VEGF и ММРs рассматривается как перспективный метод таргетной терапии опухолей. Одним из первых на такую возможность указал J. Folkman в 1971 году.
8. Способность к инвазии в окружающие ткани за счет синтеза и секреции протео- и липолитических ферментов (MMPs, коллагеназа, эластаза, миелопероксидаза и другие) и снижения адгезии между клетками новообразования по сравнению с клетками неизмененных тканей. В опухолевой ткани происходит нарушение привычной для исходного типа ткани цитоархитектоники, изменение качественного состава протеинов стромы опухоли с преобладанием их отдельных видов (напр., коллагена) или с частичным замещением их синтезированными неопластическими клетками протеинами, обладающими антиадгезивными свойствами (напр., повышенная экспрессия гликопротеина тенасцина отмечена при различных формах молочной железы, глиомах и астроцитомах). Инициирование инвазивного роста неопластической клеткой является точкой отсчета развития опухолевого узла;
9. Способность к метастазированию – перемещению с током жидкостей в другие органы и ткани организма с развитием в них вторичных опухолевых очагов [2 – 4].
Сам процесс возникновения злокачественной опухоли – канцерогенез – протекает в несколько стадий. Стадия инициации возникает спонтанно или при первичном действии канцерогенного агента (инициатора) на нормальную клетку организма и заключается в возникновении мутаций в ее генетическом аппарате, потенциально приводящих к образованию опухоли.
Промоция – вторая стадия канцерогенеза – сопровождается действием промоторов – веществ, активирующих инициированные клетки. Это фенотипические изменения, вызванные нарушением синтеза и экспрессии протеинов, ферментов и рецепторов клетки с неопластическим изменением процессов внутриклеточной регуляции. Происходит изменение характера взаимодействия клетки, подвергшейся злокачественной трансформации, с микроокружением, что еще больше нарушает регулирование процессов дифференцировки и пролиферации [4]. Клетки опухолевого клона приобретают неограниченный пролиферативный потенциал.
Трансформирующиеся клетки подвергаются значительному воздействию со стороны защитных систем организма, стремящихся к их элиминации. Таким образом, в процессе естественного отбора, наблюдается не только количественное увеличение пула неопластических клеток, но и их качественные изменения. Дополнительные мутации с селекцией наиболее пролиферативно-активных опухолевых клеток (клональная селекция) приводят ко все более быстрому росту и озлокачествлению опухоли.
В процессе опухолевой трансформации клетки утрачивают большую часть рецепторов, через которые ими можно управлять при помощи гормональных, нейромедиаторных, иммунных и прочих сигналов, а также осуществлять контактное управление (ингибирование). В то же время клетки некоторых опухолей, в т.ч. злокачественных, сохраняют часть таких рецепторов. Эти опухоли (гормоно-, химио- и пр. – чувствительные), как правило, лучше поддаются терапии.
Результатом является выделение из общей опухолевой массы, обособление и превалирование все более и более агрессивных злокачественных субклонов, т.е. субклонов в максимальной степени избегающих действия эффекторов противоопухолевого иммунитета и способных к инвазии и метастазированию. Эти процессы отражают суть третьей стадии канцерогенеза – опухолевой прогрессии.
Образование опухолевых клеток в организме происходит постоянно, однако в большинстве случаев они немедленно обнаруживаются, идентифицируются иммунной системой и оперативно уничтожаются. В норме иммунная система блестяще справляется с этой задачей, задействуя как клеточные (Т-киллеры, NK-клетки), так и гуморальные механизмы (антитело-опосредованный комплемент-зависимый лизис, АЗКЦ и пр.) однако при возникновении даже незначительных кратковременных дефектов иммунитета (в том числе и под влиянием канцерогенов) своевременного обнаружения и уничтожения опухолевых клеток не происходит.
Заключительной стадией развития злокачественной опухоли является собственно формирование первичного опухолевого узла и процесс метастазирования. Метастазирование – комплексный, стадийный процесс диссеминации злокачественного новообразования. Метастазы опухолей могут распространяться гематогенно (с током крови), лимфогенно (с током лимфы), имплантационно (в случае прямого контакта серозных оболочек с первичным опухолевым очагом) и по физиологическим пространствам организма (по ходу нервных стволов, по синовиальным влагалищам). Показано, что различные гистологические типы опухолей имеют свои преимущественные пути метастазирования.
Выделяют следующие стадии процесса метастазирования:
- интравазация – проникновение опухолевых клеток внутрь кровеносных и лимфатических сосудов или серозных полостей и синовиальных влагалищ путем инвазии. Интравазации, как правило, предшествуют активация неоангиогенеза и ослабление межклеточных контактов в опухолевой ткани;
- диссеминация или циркуляция – распространение опухолевых клеток с током крови, лимфы и серозной жидкости;
- опухолевая эмболия – прикрепление опухолевых клеток к стенке сосуда или серозной оболочки на отдалении от первичного опухолевого узла;
- экстравазация – инвазия опухолевых клеток через стенку сосуда или серозной оболочки в прилегающие ткани;
- развитие вторичного (метастатического) опухолевого узла.
Классификация опухолей:
- По гистологическому типу (согласно положениям Комитета по номенклатуре опухолей):
1. Эпителиальные опухоли без специфической локализации;
2. Эпителиальные опухоли покровов (органоспецифические) и опухоли железистой ткани;
3. Мезенхимальные опухоли;
4. Опухоли из меланинобразующей ткани;
5. Опухоли из нервной ткани и оболочек мозга;
6. Опухоли системы крови;
7. Тератомы.
- По локализации:
1. Опухоли кожи;
2. Опухоли нервной системы;
3. Опухоли головы и шеи;
4. Опухоли почки и т.д.
- По системе TNM:
1. Т – характеристика первичного очага опухоли (объем);
2. N –наличие/отсутствие метастазов в регионарных лимфоузлах;
3. M – определение наличия/отсутствия отдаленных метастазов;
4. G – характеристика степени дифференцировки неопластических клеток;
5. Р – степень прорастания стенки полых органов;
6. R – наличие/отсутствие опухоли после проведенного лечения.
Патогенез неопластического процесса складывается из местного и системного действия. Под местным действием новообразований подразумеваются эффекты, связанные с увеличением объема опухолевого узла и с инвазией опухоли в близлежащие ткани: сдавление и/или смещение опухолью органов и тканей с нарушением их функции, прорастание полых органов и кровеносных сосудов, нарушение гемодинамики и лимфооттока и т.д.
Системное действие опухолей формирует паранеопластические синдромы (ПНС) – патологические состояния, сопровождающие течение неопластического процесса, и, зачастую, являющиеся непосредственной причиной гибели пациента. ПНС представляют собой результат воздействия на организм со стороны опухоли различными соединениями (цитокины, ферменты, гормоны и т.д.).
Условно ПНС можно разделить на несколько групп:
1. Эндокринные ПНС (гиперкортицизм - эктопическая продукция АКТГ при раке легкого, гиперкальцийемия – при остеосаркомах, метастатическом поражении костей, гипогликемия – при инсулиномах);
2. Гематологические ПНС (синдром Труссо – гиперактивация системы гемостаза, полицитемия (патологический эритроцитоз) – гиперсекреция ЕРО при раке почки, анемический синдром – при хронических кровотечениях, нарушениях метаболизма железа, ингибировании эритропоэза и синтеза ЕРО, снижении средней продолжительности жизни эритроцитов, прямом разрушении костного мозга неопластическими клетками…);
3. Невральные ПНС (миастения – при тимомах);
4. ПНС кожи и слизистых (дерматомиозит – при раке легкого и молочной железы, гемолитико-уремический синдром – при раке желудка, гемангиомах);
5. Общие или неклассифицируемые ПНС (синдром лихорадки, кахексии – синтез цитокинов TNF-α, IL-6, IL-1).
Необходимость понимания причин возникновения неопластических заболеваний, детальных характеристик развития опухолевого процесса и невозможность проведения экспериментальных исследований на человеке делают основным методом экспериментальной онкологии – моделирование злокачественных опухолей на лабораторных животных. Широкий спектр применяемых моделей онкогенеза позволяет изучить его с различных сторон, выявить общие закономерности и создать теоретическое обоснование методов терапии опухолей [6]. Различают спонтанные опухоли животных, в т.ч. опухоли у инбредных животных, перевиваемые, индуцированные опухоли и модели, использующие злокачественные опухоли организма человека. Наиболее часто используемыми моделями являются модели перевиваемых опухолей.
Впервые попытку трансплантации («перевивки») опухоли животному осуществил Бернард Пейрилье в 1773 году, подкожно введя через рану на спине собаки гомогенат рака молочной железы женщины. Опыт завершился неудачей, как и целый ряд других исследований предпринятых учеными Западной Европы в XVIII – XIX вв. Российская школа экспериментальной патологии по праву гордится именами Михаила Матвеевича Руднева (1837-1878) и Мстислава Александровича Новинского (1841-1914) – основоположников экспериментальной онкологии. М.М. Рудневым впервые были разработаны принципы трансплантации опухолей и создания группы перевиваемых опухолей (1870), блестяще воплощенные на практике его сотрудником и учеником М.А. Новинским (1877). М.А. Новинский впервые осуществил успешную трансплантацию злокачественной опухоли от одной собаки другой. Впоследствии, на основе этих разработок и в Росси и за рубежом были созданы многочисленные перевиваемые модели неопластического процесса, исследования на которых придали необходимый импульс развитию теоретической и практической онкологии в XIX – XX вв.
Цель занятия:
1. Воспроизвести развитие опухолевого процесса на модели лимфосаркомы Плисса.
2. Наблюдать развитие паранеопластического анемического синдрома при опухолевом процессе.
Дата добавления: 2019-03-09; просмотров: 181; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!