Причины ошибок при заливке в парафин и резании материала
Можно рекомендовать ряд способов устранения ошибок, встречающиеся при заливке и резании гистологического материала:
1) Парафин крошится. Причина этого заключается в том, что при за-ливке парафин охлаждался слишком медленно, или он был чрезмерно твер-дым. Такой блок необходимо расплавить в термостате и снова перезолить материал. Другой причиной такой ситуации может быть низкая температура окружающей среды. В таком случае в новой заливке нет необходимости, достаточно изменить температурный режим помещения или рабочего стола, или просто подуть с близкого расстояния на блок для согрева.
2) Отделение залитого материала от парафина. При таких обстоятельствах возможно и выпадение материала из блока парафина. Причина этого явления заключается в том, что материал при заливке уже охладился или заливался в охлажденный парафин. В этом случае материал необходимо залить заново. Другой причиной может быть недостаточное удаление из материала спирта, применявшегося для обезвоживания. В таком случае парафиновый блок расплавляют, и материал переносят в «промежуточное вещество», после чего заливают заново согласно общепринятым правилам.
3) Плоскость среза блока неоднородна, белого цвета. Причина такого состояния в плохом обезвоживании. При такой ситуации блок расплавляют и материал пропускают в обратном порядке через обезвоживающий ряд спиртов до абсолютного спирта, затем снова заливают.
|
|
|
4) Материал плохо или вовсе не режется, нож подскакивает по поверхности блока, плоскость среза неровная.Данная картина объясняется переуплотнением материала при фиксации. Исправить данную ошибку уже невозможно, но можно попытаться подготовить срезы толщиной 15-20 микрон по методу Оршоша. Суть метода заключается в том, что срезы осторожно переносят на пергаментную бумагу и опускают в теплую воду, чтоб дать раскрутиться и расправится. При этом нужно помогать препоровальной иглой или кисточкой. При выпрямлении закрученных срезов надо пользоваться предварительно прокипяченной дистиллированной водой, что также предотвращает образование в срезах пузырьков воздуха. При резании вышеописанных блоков необходимо сильно подышать на блок для согревания, что дает хорошие срезы. Возможен другой способ получения хороших срезов, когда при каждой резке на поверхность блока кисточкой наносят горячий парафин, дают ему слегка остыть, потом делают срезы.
5) Срезы разрываются. Причиной таких срезов является наличие зазубрин на ноже или же плохая декальцинация материала. Данная ситуация может быть обусловлена загрязнением материала во время заливки, когда попадают песчинки пыли или иных частиц.
|
|
|
6) Срезы полосатые.Причина - наличие зазубрин на лезвие ножа.
7) Срезы закручиваются, прилипают к поверхности ножа.Данная картина может быть при слишком мягком парафине или сравнительно высокой температуре в помещении. Материал необходимо залить в более твердый парафин или перед резанием материал держать в холодной воде, можно в холодильнике.
8) Не все срезы пригодны для исследования.Срезы слишком тонкие для данного материала, или материал плохо залит. В таком случае необходимо увеличить толщину среза на несколько микрон. Другая причина – слишком велик угол наклона ножа.
9) Плохое качество срезов.Необходимо изменить угол наклона ножа для резания.
10) В сухое время года или сухости воздуха помещения срезы электризуются и прилипают к лезвию ножа.Изменить возникшее состояние, возможно просто дыша на нож.
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДИКИ ДЛЯ ОКРАСКИ МИКРОПРЕПАРАТОВ
Методики для обзорного гистологического исследования.
Гистологическое исследование тканей проводится после окраски материала с применением обзорных методик. Целью окраски является выявление структурных особенностей ткани, состояние ядерной субстанции. Во многих случаях достаточно применение окраски гематоксилином и эозином. Красители ядер являются основными, а для оценки состояния протоплазмы кислотными, поэтому при их применении, Конечно, окрашиваются все те клеточные и тканевые элементы, которые имеют сродство с этими красителями.
|
|
|
Окраска ядер. Для окраски ядер чаще применяют гематоксилин, а также кармин. Кроме этого избирательным окрашиванием ядер обладают сафранин, галлоцианин.
Гематоксилин – применяется в виде квасцового раствора или после обработки квасцами. Краситель может быть пригодным после созревания. Сущность созревания заключается в окислении гематоксилина в гематеин, для чего требуется от нескольких дней до недель. Процесс созревание раствора гематоксилина можно ускорить. В этом случае краситель можно применять сразу. Существует значительное число видов гематоксилина. Рекомендуются следующие виды гематоксилина:
1. Кислый гематоксилин Эрлиха.
Способ приготовления: В 100,0 мл 96% спирта растворить 2,0 г гематоксилина , прибавить 100,0 мл дистиллированной воды, затем 100,0 мл чистого глицерина, 3,0 г калийных квасцов (химически чистый), 10,0 мл ледяной уксусной кислоты, взболтать и оставить на свету «созревать» в течении 14 дней, периодически взбалтывая.
|
|
|
Для того чтобы обеспечить постоянный доступ воздуха, при котором происходит процесс окисления гематоксилина, следует брать широкогорлый сосуд и накрыть отверстие несколькими слоями марли.
Результат. В процессе «созревания» раствор из светло-красного становится темно-красным. Готовый раствор долго сохраняет свои свойства при хранении в плотно закрытом сосуде.
2. Гематоксилин Бемера.
Способ приготовления: В 100,0 мл 100% спирта растворить 1,0 г кристаллического гематоксилина и добавить 200,0 мл 10% водного охлажденного и профильрованного раствора калийных квасцов.
Результат. Раствор «созревает» на свету в течение 4-5 дней, после чего он готов к применению. Перед применением раствор каждый раз фильтруют. Необходимо помнить, что со временем раствор портится и готовят свежий раствор.
3) Гематоксилин Делафильда ( Delafield).
Способ приготовления: 40,0г кристаллического гематоксилина растворяют в 25,0 мл абсолютного спирта и прибавляют 400.0 мл насы-щенного водного раствора аммиачных квасцов (на 400,0 мл дистиллиро-ванной воды берут приблизительно 40,0 г аммиачных квасцов). Приготовленный раствор помешают в банку с широким горлышком и держат на свету 3-4 дня, затем фильтруют. К фильтрату прибавляют 100,0 мл глицерина и 100,0 мл чистого метилового спирта. Оставляют на свету в широком стакане ещё на несколько дней и снова фильтруют.
Окраска. Для регрессивной окраски время окрашивания 4-6 минут. При этом необходимо разбавить гематоксилин дистиллированной водой в равном объёме. После окраски срезы прополаскивают сначала в дистиллированной воде, затем водопроводной. Дифференцировка осуществляется под контролем микроскопа с применением 1% солянокислым спиртом или насыщенным водным раствором пикриновой кислоты. После дифференцировки и промывания с частой сменой в водопроводной воде минуем до 30 минут.
Приготовление солянокислого спирта: к 100,0 мл 70% спирта прибавляют 1,0 мл концентрированной соляной кислоты.
Результат окрашивания: Ядерный хроматин ярко синего цвета.
4) Приготовление гематоксилина, тотчас же пригодного к употреблению.
Способ приготовления: Готовят два раствора: а) 1,0 г гематоксилина растворяют в 10,0 мл 96% спирта; б) 20,0 г гематоксилина растворяют в 200,0 мл теплой дистиллированной воды. Оба раствора после полного растворения сливают и быстро доводят до кипения. В кипящую смесь прибавляют 0,5 г hidrarg. oxid. flavum, смесь за 2-3 секунды становится синевато-лилового цвета. После чего прекращают нагревание, смесь быстро охлаждают (например, в ледяной бане) и фильтруют.
Результат. Раствор может сохраняться неограниченное время.
При избирательном окрашивании ядра после фильтрации к раствору прибавляют 5% ледяной уксусной кислоты. Раствор может применяться лишь в течение 2-3 недель. Процесс окраски и результат аналогичен как гематоксилином без ускоренного созревания.
5) Железный гематоксилин Гейденгейна
Дает хороший эффект лишь в случае тонких срезов не более 5 микрон. Применение его требует большого навыка. Применение дает возможность выявления очень нежных деталей ядерной структуры.
Способ приготовления: Срезы перед окрашиванием протравливают в течение 2-12 часов 2,5% раствором железных квасцов. (Для приготовления красителя пригодны кристаллы железных квасцов только фиолетового цвета). После протравки делают прмывку в дистиллированной воде, затем окрашивают раствором гематоксилина (1,0 грамм гематоксилина растворяют в 10,0 мл 96% спирта, прибавляют 90,0 мл дистиллированной воды и оставляют «созревать» не менее 4 недель) в течение 1-36 часов. Гематоксилин перед употреблением доводят до двойного объёма. Однако для окрашивания можно пользоваться более разведенными растворами. Далее окрашенный срез при контроле под микроскопом дифференцируют, в качестве протравы применяют железоаммиачные квасцы. Срез предварительно промывают водой. После дифференцировки снова промывают в водопроводной воде в течение 30 минут при частой смене воды.
Результат. Ядерная структура, ядрышки, клеточный центр, поперечная полосатость поперечнополосатой мускулатуры окрашиваются в черный или синевато-черный цвет.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 2521; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!