Фиксаторы. Общие правила фиксации гистологического материала
1. Используется гистологически чистая, и только стеклянная посуда, лучше применять банки с широким горлом для удобства закладки материала.
2. Перед погружением в фиксатор материал недопустимо обмывать водой.
3. Объем фиксирующей жидкости, в который погружается материал, должен быть в 20-40- раз больше объёма всех взятых кусочков.
4. На дно сосуда обычно помещается кусочек гигроскопической ваты или марли, что дает возможность равномерному обмыванию всего материала.
5. Материал необходимо сразу погрузить заранее приготовленный фиксатор.
Желательно каждый кусочек завязывать в отдельный мешочек из марли. В таком случае в одну банку можно помещать несколько перевязанных мешочков, где находится материал, с соблюдением маркировки.
6. Удобно прошивать кусочки белой ниткой (избегать цветных ниток, так как они в дальнейшем окрашивают спирт). К свободному концу пришивают бирки из плотной бумаги. Надписи делают простым карандашом (не химическим!).
7. Кусочки не должны превышать размер 10-15 мм. в длину, и 5-10 мм. в ширину и 3-4 мм в толщину.
8. Ткани полых органов перед погружением необходимо фиксировать (прикреплять) к пробке или картону стеклянными иглами или прошивать.
9. Фиксирующую жидкость нужно срочно поменять, если она помутнеет.
10. Фиксатор используется однократно, крайне редко вторично.
11. Фиксатор следует готовить непосредственно перед употреблением.
|
|
|
12. Фиксацию проводят при комнатной температуре.
13. Для ускорения фиксации банку с взятыми кусочками можно поставить в термостат при температуре 37-40 градусов. В современных условиях можно использовать бытовые микроволновые печи.
14. Время фиксации зависит от вида фиксатора.
15. Материал необходимо держать в фиксаторах по времени согласно рекомендациям, данных по прописи в руководствах по гистологической технике.
Виды фиксаторов и их характеристика.Приводим наиболее часто применяемые фиксаторы, которые используются в практической работе гистологических лабораторий. Фиксирующие средства делятся на фиксирующие вещества (простые фиксаторы) и фиксирующие смеси (сложные фиксаторы).
Простые фиксаторы- к ним относятся различные обезвоживающие вещества: этиловый и метиловый спирт, ацетон; соли тяжелых металлов: сулема, хлорид платины и другие вещества, а также уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, сульфосалициловая кислота, пикриновая кислота, осмиевая кислота и формальдегид.
Наиболее часто из простых фиксаторов гистологической практике используются следующие вещества:
Этиловый спирт(этанол). Чаще используется абсолютный (безводный) спирт или 96 0 . Время фиксации - 12-24 часа, за этот период рекомендуется менять спирт 3-4 раза. Удельный вес спирта, разведенного водой, больше, чем концентрированного, поэтому исследуемый материал не следует класть на дно посуды, а лучше подложить под него обычной или стеклянной ваты. Положительным качеством этого фиксатора является, что материал можно использовать для гистохимических исследований, белок тканей подвергается минимальным химическим изменениям, сохраняет в тканях гликоген, железосодержащий пигмент – гемосидерин, кальций, мукоидные вещества и мочевую кислоту. Отрицательная сторона, что при этой фиксации материал быстро обезвоживается, сморщивается, быстро растворяются липоиды и гемоглобин. Для обычных гистологических исследований в связи со сморщиванием тканей спиртовая фиксация не используется.
|
|
|
Для приготовления абсолютного спирта проще всего налить 96 % спирт на прокаленную сернокислую медь. Сернокислая медь, лишенная входящей в её структуру кристаллизационной воды, имеет вид серовато-белого порошка. Она отнимает воду от спирта и при этом приобретает синий цвет. Процесс обезвоживания лучше проводить постепенно в двух или трех сосудах. При этом сернокислая медь остается почти обезвоженной и спирт можно хранить длительное время. Абсолютный спирт из сосуда лучше брать осторожно пипеткой, чтоб не взболтать сернокислую медь или опустить над слоем порошка фильтровальную бумагу. Для прокаливания сернокислую медь кладут в фарфоровую чашку и нагревают длительное время при температуре 200 градусов. Прокаливание рекомендуется проводить в специальном помещении, так как порошок раздражает слизистые оболочки.
|
|
|
Метиловый спирт (метанол) является лучшим фиксатором высушенных на воздухе мазков крови и красного костного мозга. Стекла с мазками в вертикальном положении помешают в стеклянную банку с притертой пробкой, в который наливают абсолютный метиловый спирт. Время фиксации 5-10 минут. Из банки стекла извлекают пинцетом и ставят ребром на фильтровальную бумагу для просушивания.
Для обезвоживания метилового спирта рекомендуется применять окись кальция с последующей дистилляцией.
Формальдегит (формол, формалин) – это самое дешевое и часто используемый фиксирующее вещество, он быстро диффундирует, хорошо фиксирует жирные кислоты, жиры и липоиды. Основное преимущество, что в формалине материал может храниться годами. Время фиксации минимум 24-48 часов.
|
|
|
Имеющийся в продаже раствор формальдегида или формалина является 40-процентным водным раствором газа формальдегида. Он применяется в разведении 1:10 – 4-процентным раствором формальдегида. Раствор формальдегида концентрация, которой превышает 10%, при длительной фиксации сильно уплотняет исследуемый материал и хранение должно быть недлительное – несколько дней!
Для фиксации гистологического материала необходимо использовать 10% раствор нейтрального формалина. Обычно для ускорения фиксации гистологический материал помещают в 10% нейтральный формалин и кипятят в течение 1 минуты, а в последние годы можно использовать микроволновую печь.
Способ нейтрализации формалина. Для нейтрализации формалин наливают в бутылку (желательно темного цвета), на дно которой кладут слой карбоната кальция или магнезии толщиной в 2-3 см. Держат формалин в таком состоянии длительное время (24-28ч.), периодически проверяя лакмусовой бумагой его реакцию, так как основная реакция также нежелательна.
Побочные действия формалина. При длительном хранении материала в формалине образуется темно-коричневый пигмент в виде зернышек или глыбок, так называемый формалин-пигмент. Для избежания этого эффекта материал после фиксации необходимо тщательно обмыть в проточной воде. Формалиновый пигмент из среза удаляется с трудом.
Способы удаления дефектов фиксации:
1) метод Верокей (Verocay), при помощи которого иногда удается добиться хорошего результата. Сущность метода заключается в следующем: готовят смесь из 1 части 1% раствора калийной щелочи и 25 частей 80% спирта и держат в ней срез в течение 10 минут, затем промывают срез в воде в течение 5 минут. При этом желательно не менее чем 2 раза сменить воду. После этого срез обрабатывают в течение 5 минут 80% спиртом и, наконец, тщательно промывают в проточной воде.
2) метод Кардашевича (Kardasewitsch). Согласно этой методике срез кладут в 70% спирт, содержащий 1-5% раствора нашатыря, и держат в этой смеси от 5 минут до 4 часов, затем тщательно промывают.
3) устранения чрезмерной плотности при длительном хранении материала в концентрированном растворе можно путем помещения материала на 2 недели в 1% раствор нитрата серебра или 10 % растворе лимонной кислоты.
Сложные фиксирующие смеси:
Ледяная уксусная кислота-спирт. Состоит из 80 мл абсолютного спирта и 20 мл ледяной уксусной кислоты. Хорошо фиксирует ядра клеток, но плохо протоплазму. Время фиксации несколько часов. Промывать исследуемый материал следует в абсолютном спирте.
Формалин-ледяная уксусная кислота (фиксирующая смесь по Руж ( Ruge)). Состоит из 20 мл формалина, 1мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл дистиллированной воды. Универсальная фиксирующая смесь.
Фиксирующая смесь по Карнуа ( Carnoy). Состоит из 63 мл абсолютного спирта, 30 мл хлороформа и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Действие очень быстрое, особенно быстро и хорошо фиксируются ядра. Протоплазма и соединительная ткань при фиксации слегка сморщиваются. Время фиксации от 10 мин до 2-3 часов, в зависимости от величины исследуемого материала.
Надо помнить, что жидкость Карнуа приготавливается перед фиксацией. Кусочки толщиной до 5 мм фиксируются в течение необходимого времени в зависимости от толщины объекта. После фиксации кусочки сразу промывают в абсолютном спирте. Если фиксатор приготовлен на 96% спирте, то кусочки следует ополоснуть 2-3 раза в 96% спирте, где можно в случае необходимости оставить их на 2-3 часа. Применяется в качестве фиксатора при многих гистохимических методиках (нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды).
Фиксирующая смесь по Шафферу ( Schaffer). Состоит из 2 частей 90-% или абсолютного спирта и 1 части формалина. Универсальная фиксирующая смесь; время фиксации 1-2 или больше дней. Материал промывают в 90-% или абсолютном спирте. Эта же смесь с 80-% спиртом хорошо подходит для фиксации богатых желтком яиц и зародышей.
Сулема-ледяная уксусная кислота. Состоит из 90-95 мл концентрированного водного раствора сулемы и 10-5 частей ледяной уксусной кислоты. Одинаково хорошо фиксирует и ядра и плазму клеток. Применяют также для фиксации зародышевых тканей. Не годится для фиксации материала, содержащего много соединительной ткани. Время фиксации 0,5-6 часов, промывание в 70-% спирте.
Фиксирующая смесь по Ценкеру ( Zenker). Состоит из 100 мл смеси Мюллера, 5,0 г сулемы и 5,0 мл ледяной уксусной кислоты. Ледяная уксусная кислота прибавляется непосредственно перед употреблением. Универсальный фиксатор. Время фиксации 12-24 часа. Промывка в проточной воде в течение 24 часов.
Фиксирующая смесь Хелли ( Helli) (Ценкер-формол). Вместо ледяной уксусной кислоты непосредственно перед употреблением к смеси Ценкера прибавляют 5,0 мл формола. Хорошо фиксирует ядра и особенно хорошо структуру протоплазмы. Время фиксации от нескольких часов до 24 часов. Промывка в проточной воде в течение 24 часов.
Фиксирующая смесь Буэна ( Bouin). 15 мл концентрированного водного раствора пикриновой кислоты, 5,0 мл формалина, 1,0 мл ледяной уксусной кислоты. Один из лучших фиксаторов. Время фиксации от 1-2 до 12-24 часов. Промывка в 80-% спирте до почти полного обесцвечивания спирта.
В зависимости от целей исследования существуют многочисленные фиксирующие средства для выявления различных тканей и её структур. Наиболее часто используются следующие фиксаторы, которые можно сгруппировать следующим образом.
1) Для общего обзора – лучшим фиксатором является 10% раствор нейтрального формалина..
2) Для цитологических исследований используется в качестве фиксатора – фиксаторы Шампи и Флеминга.
3) Для исследования структуры ядра и деления клеток – фиксаторы Буэна, Карнуа, Флеминга, смесь, состоящая из ледяной уксусной кислоты и формалина, или хлорид платины в разведении 1:300.
4) Для изучения структуры протоплазмы – фиксаторы Максимова, Хелли, Ценкера.
5) Для фиксации гликогена – используется абсолютный спирт, фиксаторы Карнуа или Саномия. При этом надо помнить, что при фиксации этими веществами промывка в воде противопоказано.
6) Для выявления жиров – рекомендуется фиксатор Чаччо, осмиевая кислота, смеси, содержащие осмий, но проще всего формалин.
7) Для выявления нейрофибрилл и глии – нейтральный формол или фиксатор Кахаля.
8) Для фиксации материала, полученного при выскабливании – применять формалин в изобилии. После фиксации материла, следует удалить кровь путем фильтрации через марлю.
9) Для исследования под флуоресцентным микроскопом рекомендуется фиксация материала формалином. Необходимо избегать фиксаторов, содержащих соли металлов.
Промывка материала. После завершения фиксации излишнее количество фиксирующей жидкости следует удалить из материала при помощи проточной воды или спирта. Простым методом промывки является, когда материал кладут в обычную стеклянную банку с широким горлом, перевязывают марлей и ставят под кран или же возможно использовать резиновый шланг, которую пропускают через марлю до дна банки и пропускают струю воды для промывки. Для промывки небольших кусочков ткани, используют марлевые мешочки, фиксированные ниткой с биркой и указанием вида материала.. даты или номера опыта и т..д.. В последующем кусочки в марлевых мешочках промывают под струей проточной воды.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 6065; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!