Тема: Учёт результатов посева воды и воздуха. Коли-титр, коли-индекс.

Санитарная оценка воды.

Цель работы: Подсчитать колонии (в чашках Петри). Ознакомиться с определением коли-титра, коли-индекса и санитарной оценкой воды, а также с определением количества микробов в почве методом прямого счета под микроскопом.

Оборудование и материалы. Чашки Петри, в которые сделан посев воды и воздуха, стерильная вода, стерильная колба, стерильные пипетки (10 мл) и микропипетки (0,1 мл), предметные стекла, крышки от чашек Петри, окулярная сетка, спиртовка, спички.

Для демонстрации хорошей и плохой воды: два ряда колб и пробирок со средой Булижа и высеянной в нее водой с коли-титром в первом ряду 0,1; во втором ряду - 100. Рост Е. coli на среде Эйкмана, РДА.

Задания:

1. Провести подсчет микроорганизмов, выросших на питательных средах, с воды.

2. Сделать описание колоний и препараты-мазки с простым методом окрашивания.

3. Провести подсчет микроорганизмов, выросших на питательных средах, с почвы.

4. Сделать описание колоний и препараты-мазки с простым методом окрашивания.

Методические указания.

Определение коли-титра. Коли-титр - наименьшее количество воды (мл), в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка. Наличие кишечной палочки в воде указывает на загрязнение ее содержимым желудочно-кишечного тракта. В отличие от других микроорганизмов воды, кишечная палочка может развиваться при температуре 43-46ºС, легко сбраживает углеводы с образованием кислоты и газа. Это свойство микроба положено в основу определения коли-титра. Существует несколько методов определения коли-титра.

Определение коли-титра на среде Эйкмана. Исследуемую воду высевают на среду Эйкмана (пептон - 1 г, натрия хлорид - 0,5 г, глюкоза - 0,5 г, водопроводная вода - 100 мл, рН 7,4-7,6). При необходимости готовят концентрированную среду, для этого количество веществ, кроме воды, увеличивают в 10 раз. Глюкозу можно заменить лактозой или маннитом. Водопроводную воду, в зависимости от численности людей в населенном пункте, сеют:

а) в городах до 1 млн. человек в объеме 300 мл: два объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл;

б) в городах свыше 1 млн. человек в объеме 500 мл: четыре объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл.

Чистую воду открытых водоемов сеют в количестве 100, 10 и 0,1 мл (1 мл воды, разведенной 10-1 ); загрязненную - 10, 1 и по 1 мл воды, разведенной 10 -1, 10 -2, 10 -3 и т.д. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С и выдерживают в течение суток. Через 7-12 ч пробирки на время вынимают из термостата и делают пересев в розоловый дифференцированный агар (РДА). На РДА выращивают микроорганизмы при 37ºС, и если имеется кишечная палочка, то через 12-17 ч среда желтеет, разрывается. Среда Эйкмана к этому времени (24 ч) мутнеет, образуется газ. При необходимости проводится идентификация Е. coli .

Состав РДА. МПА (рН 7,4-7,6) 100 мл, желчи 5 мл, лактозы 1 г, глюкозы 0,1 г, 1%-ного спиртового раствора индикатора бромтимолового синего и 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты по 0,2 мл. Среду разливают по 3-4 мл в пробирки и стерилизуют в течение 15-20 мин при температуре 112°С. Часть среды скашивают, так как посев делают уколом и на скошенную поверхность.

Посевы помещают в термостат на сутки при температуре 43°С. Рост сапрофитной микрофлоры при этой температуре подавляется. При наличии кишечной палочки она сбраживает маннит, индикатор (нейтральный красный) редуцируется, и среда принимает соломенно-желтое окрашивание, мутнеет, в «газовках» появляется воздух.

Для того чтобы убедиться, что изменения произведены кишечной палочкой, из пожелтевшей среды делают посев на среду Эндо. Посевы на среде Эндо помещают в термостат (37°С) на сутки. Появление красных с металлическим блеском колоний, обнаружение при микроскопии грамотрицательных палочек и соответствующих изменений на цветном ряду подтверждают наличие кишечной палочки.

Определение коли-индекса методом мембранных фильтров. Мембранные фильтры, употребляемые при исследовании воды, имеют различную проницаемость и разные номера. Наиболее часто применяют фильтр №3. Фабричные фильтры дважды кипятят в дистиллированной воде (в химическом стакане). Затем подготовленные бумажные фильтры накладывают матовой поверхностью кверху на сетку асбестового фильтра Зейтца. Через фильтр пропускают определенное количество воды (до 500 мл, в зависимости от загрязнения). После фильтрации с помощью фламбированного пинцета фильтр кладут блестящей поверхностью на среду Эндо в чашки Петри. Чашки ставят в термостат при температуре 37°С или лучше при 43°С на сутки. На белой поверхности фильтров при наличии кишечной палочки появляются красные колонии, которые и подсчитывают. Методом мембранных фильтров определяют коли-индекс, то есть количество кишечных палочек, содержащееся в 1 л воды. Для перевода коли-титра в коли-индекс необходимо 1000 разделить на число, показывающее коли-титр. Для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли-индекс.

Пример. При коли-титре, равном 10, коли-индекс равен 100. При коли-индексе, равном 5, коли-титр равен 200.

Санитарная оценка воды. Согласно ГОСТ 2874-73 на питьевую воду, общее количество микробов (микробное число) в 1 мл. при посеве не разведенной воды и выдерживании ее в течение 24 ч при 37 °С должно быть не более 100. В 1 л воды при определении методом мембранных фильтров кишечных палочек должно быть не более трех. При использовании бродильных проб титр кишечной палочки должен быть не менее 300. К водопроводной воде в городах с населением свыше 1 млн. человек должны предъявляться более высокие требования.

Вода открытых водоемов считается хорошей при коли-титре 100, коли-индексе 10. При коли-титре ниже 1 вода непригодна к употреблению. Следовательно, чем выше коли-титр, тем вода чище, лучше, и наоборот, чем ниже, тем качество ее хуже.

Для демонстрации плохой и хорошей воды открытых водоемов ее высевают на среду Булижа: в первый ряд - с коли-титром 100 и выше (вода хорошая); во второй - с коли-титром 0,1 и ниже (вода плохая). По изменению окрашивания среды (от малиново-красной до желтой) можно установить наличие кишечной палочки в определенном объеме исследуемой воды и ее качество.

Подсчет колоний в чашках Петри. На мясопептонном агаре в чашках Петри подсчитывают выросшие колонии из разведении 10-2, 10-1 и неразведенной воды. После подсчета колоний получаемый результат умножают на разведение и определяют среднее число. Качество воды оценивают по содержанию микробов в 1 мл:

Хорошая вода до 100

Сомнительная вода от 100 до 500

Плохая вода от 500 и более

Определение численности микробов в почве методом прямого счета. Наряду с другими методами число микробов в почве можно определить прямым подсчетом их под микроскопом. Такие методы разработаны С. Н. Виноградским (1952), Д. Г. Звягинцевым (1959) и другими исследователями. Подсчет микробов по Виноградскому проводят под обычным световым микроскопом, в то время как для выполнения подобной работы по Звягинцеву требуется флуоресцентный микроскоп, который может быть не в каждой студенческой лаборатории.

Метод прямого счета микробов под микроскопом, предложенный С. Н. Виноградским, имеет ряд достоинств, но он громоздок, поэтому его чаще применяют в модификации О. Г. Шульгиной. Он сводится к следующему. Из средней пробы отвешивают 5 г почвы и вносят в эрленмейеровскую колбу объемом 250 мл. Почву заливают 50 мл стерильной воды, встряхивают в течение 5 мин, после чего в течение 1 мин отстаивают. Из колбы стерильной пипеткой берут 0,01 мл суспензии и распределяют ее на площади 4 см2 предметного стекла (под стекло кладут очерченный квадрат такой же площади). После подсушивания препарат заливают тонким слоем 0,1%-ного водного раствора агара, вновь подсушивают, фиксируют 96 %-ным этиловым спиртом в течение 10-20 мин и окрашивают 1-2 мин фуксином основным феноловым Циля или другим красителем. Затем краситель сливают и смывают его путем погружения стекла до 5 раз в стакан с водой. Высушивают на воздухе. Количество клеток подсчитывают под иммерсионным объективом микроскопа в 50-100 квадратах окулярной сетки, которую помещают на постоянную металлическую диафрагму между глазной и собирательной линзами окуляра. При объективе х90 и окуляре хI0 сторона клетки окулярной сетки равна 0,02 мм, а ее площадь 0,0004 мм2.

Расчет. При увеличении в 900 раз на площади в 1 см² вмещается 25х104 квадратов окулярной сетки (1 см2 = 100 мм2, 100 мм2 : 0,0004 = 25х104 ).

Для определения микробов в 1 г почвы необходимо среднее количество клеток в одном квадрате окулярной сетки умножить еще на 1000, так как в 0,01 мл суспензии содержится 0,001 г почвы. При наличии в квадрате окулярной сетки трех микробных клеток в 1 г почвы их будет 3х10 9, при наличии пяти - 5х109 и т. д.

Контрольные вопросы:

1. Какие методы оценки микрофлоры в воде существуют?

2. Что такое коли-титр и коли-индекс?

3. Как определить количество микроорганизмов методом прямого счета?

4. Какие методы оценки микрофлоры в почве используют в почвенной микробиологии?

Коллоквиумы

Для успешного освоения практического курса по «Микробиологии и основам вирусологии» необходимо проводить контроль знаний, умений и навыков студентов. Лабораторный практикум предполагает проведение 3-х коллоквиумов. 1-й коллоквиум определяет знания, умения и навыки, полученные студентами, при выполнении 1-4 работ; 2-й коллоквиум – 5-9 работ и 3-й коллоквиум – 10-18 работ.

К коллоквиумам студент должен повторить материал всех занятий, сдать отчеты по пройденным лабораторным работам. Помимо собеседования, коллоквиумы обязательно включают проверку умений пересевать культуру и готовить препараты микроорганизмов, работать со светлопольным микроскопом, фазово-контрастным устройством и темно польным конденсором, готовить среды и посуду к стерилизации, описания культуральных и морфологических свойств микроорганизмов, их размеров и численности, знания методов выделения определенных групп микроорганизмов из воздуха, воды и почвы, умения работать с санитарно-показательными микроорганизмами и знания методов оценки санитарного состояния природных экотопов .

Результаты работ должны быть оформлены в виде краткого письменного отчета и сданы преподавателю. Особое внимание следует уделять аккуратности и точности оформления рисунков и схем, правильности подписей к ним, которые являются неотъемлемой составляющей успешной работы микробиолога.

Внимание! Если студент не сдал отчеты по лабораторным занятиям, он не допускается к текущему коллоквиуму. Если не сданы лабораторные работы и коллоквиумы, то студент не допускается к сдаче экзамена по всему курсу.

ЛИТЕРАТУРА

Основная:

Практикум по микробиологии/ Под ред. А.И. Нетрусова. Образовательно-издательский центр «Академия», 2005. 608 с.
Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева К.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1994.
Методы общей бактериологии: в 3 т./ Под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир, 1984.
Определитель бактерий Берджи: в 2 т./ прод ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.: Мир, 1997.
Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: Агропромиздат. 1990. 240 с.

Дополнительная:

1. Большой практикум по микробиологии/ Под ред. Г.Л. Селибера. М.: Высшая школа, 1962.

2. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. М.: Медицина, 1993.

3. Методы почвенной микробиологии и биохимии/ Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991.

4. Стейниер Р. И др. Мир микробов: в 3 т. М.: Мир, 1979.

5. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1986.

Дата добавления: 2018-10-26; просмотров: 643; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 10 11 12 13 14 15 16 17 1819

Мы поможем в написании ваших работ!