Тема: Количественный учет микроорганизмов.
Цель работы: Изучить методы количественного учета микроорганизмов.
Материал и оборудование: микроскоп, счетная камера Горяева, бактериологическая петля, предметные стекла, капельница с водным фуксином, генциан-виолетом, спиртом, водой, иммерсией, вата, салфетки, карандаш по стеклу, миллиметровая бумага, дезинфицирующий раствор, стерильная вода в пробирках, суспензия культуры Proteus vulgaris , дрожжи, объект-микрометр.
Задание.
1. Определить количество клеток микроорганизмов в заданной суспензии методом Брида.
2. Определить количество микроорганизмов в суспензии с помощью счетной камеры Горяева― Тома. '
Методические указания.
Интенсивность роста микроорганизмов в питательных средах, а также содержание микроорганизмов в каком-либо субстрате оценивают по числу клеток или по биомассе в единице объема. Выбор того или иного метода для определения количества клеток или биомассы зависит от морфологических особенностей изучаемых микроорганизмов, характера роста, свойств культуралъной среды, а также целей исследования.
Подсчет клеток в счетной камере. Метод применим только для подсчета достаточно крупных объектов ― дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Для подсчета микроорганизмов обычно используется камера Горяева-Тома. Счетная камера представляет собой толстое стекло, разделенное бороздками. На центральной части стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки в камере Горяева указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм (большой квадрат). Часть предметного стекла, на котором нанесена сетка, ниже двух других сторон - это глубина камеры. Глубина камеры всегда указана на предметном стекле и равна 0,1 или 0,2 мм.
|
|
|
Для соответствия расчетного значения объема камеры и объема находящейся в ней суспензии клеток, покровные стекла притирают, а затем из пипетки осторожно заполняют камеру суспензией микроорганизмов. Подвижные формы микроорганизмов перед заполнением камеры необходимо убить нагреванием или суспензированием в формалине (0,5%).
Подсчет числа клеток проводят с объективом х8 или х40 с иммерсионным объективом работать нельзя, т.к. фокусное расстояние иммерсионного объектива меньше, чем толщина стекла камеры. Обычно подсчитывают количество клеток микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах, перемещая последние по диагонали. Количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом ― 10, в противном случае суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток должно быть не менее 600. Количество клеток в 1 мл. исходной суспензии вычисляют по формуле:
|
|
|
М = а х 1000 х n / h x S ,
где М – число клеток в 1 мл суспензии; а - среднее число клеток в квадрате сетки; h - глубина камеры в мм; S - площадь квадрата сетки в мм2, 1000 мм3 =1 мл, n - разведение исходной суспензии.
Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида). Преимущество этого метода заключается в возможности учитывать клетки микроорганизмов меньших размеров, т. к. подсчет проводят на окрашенных препаратах с использованием иммерсионного объектива х90. Точно калиброванной пипеткой отмеряют 0,02, 0,05, 0,1 мл. суспензии и распределяют на площади в 4, 6, 1 см2 соответственно (одну каплю из пипетки на 1 мл с хорошо оттянутым носиком). Мазок сушат, фиксируют и красят метиленовой синью или фуксином Циля. Считают количество микробов в отдельных полях зрения. Диаметр поля зрения определяют с помощью окуляр-микрометра. Последний помещают на столик микроскопа вместо, препарата и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют диаметр поля зрения. Площадь поля зрения вычисляют по формуле.
|
|
|
Общее количество подсчитанных клеток микроорганизмов не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исходной суспензии, вычисляют по формуле:
М = a x S x n/ S' x V,
где М - количество клеток в 1 мл исходной суспензии, а - среднее число клеток поля зрения, S - площадь зрения в мк2, V - объем, нанесенной на стекло суспензии в мл.; S' - площадь приготовленного мазка в мк2 (1 мм = 100 мк), n - разведение исходной суспензии.
Контрольные вопросы:
1. В чем сущность подсчета клеток в камере Горяева-Тома?
2. Подсчет клеток по методу Виноградского-Брида.
3. Какие существуют еще способы подсчета микробных тел?
4. Заполните форму 5, указав, какие существуют способы подсчета микробных тел, в чем их сущность и где используются.
Форма 5
| Способ подсчета | В чем его сущность | Где используется |
.
Лабораторная работа № 15
Дата добавления: 2018-10-26; просмотров: 798; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!