Морфологические признаки дрожжей
Форма вегетативных клеток разнообразна: округлая, овальная, яйцевидная, цилиндрическая, апикулятная или лимоновидная. Несовершенные дрожжи имеют более характерную форму, отличающуюся от других видов: стреловидную, треугольную. Дрожжи некоторых родов наряду с округлыми и овальными клетками могут образовывать длинные клетки псевдомицелия.
В среднем размер клеток дрожжей, применяемых в пищевой промышленности, колеблется от 2,5 в поперечнике до 5 мкм и длина от 4,5 до 21 мкм. Формы и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования. Для изучения морфологии дрожжи выращивают на стерильном солодовом сусле концентрацией 8-10 % СВ, сусло-агаре, глюкозопептонной жидкой среде или глюкозопептонном агаре в течение 2-3 суток при 25-28 оС. Медленнорастущие дрожжи микроскопируют через 1-2 недели. Затем культуры оставляют при комнатной температуре и еще раз описывают через 4 недели.
Выявление включений клетки
Гликоген - это запасной полисахарид, мономером которого является α-D-глюкоза, который обнаруживают при помощи прижизненной окраски дрожжевых клеток раствором иода или Люголя. Количество гликогена в клетках дрожжей меняется в зависимости от их возраста и условий питания. Гликоген появляется в клетках, находящихся в стационарной фазе роста, в период главного брожения, и накапливается в большом количестве, когда 2/3 сахаров сусла сброжены. Если же весь сахар сусла сброжен, то гликоген в дрожжах перестает накапливаться.
|
|
|
Техника определения. Для определения количества гликогена в дрожжевых клетках на предметное стекло, предварительно протертое марлевой салфеткой, наносят маленькую каплю воды (можно наносить петлей). Далее добавляют петлей небольшое количество биомассы дрожжей – еле заметное глазом на конце петли – (или 1 каплю дрожжевой суспензии) и 2 капли 0,5 % раствора иода (0,5 г иода и 1 г KI на 100 мл воды). Капли смешивают, накрывают подготовленным покровным стеклом, отбирают излишек жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя объектив микроскопа 40х. При соотношении дрожжей и раствора иода (1:2) через 2-3 мин клетки дрожжей окрашиваются в светло-желтый цвет, а гликоген – в коричневый. Можно добавлять еле заметное количество биомассы дрожжей в каплю раствора Люголя.
В нормальных зрелых дрожжах гликоген занимает от 2/3 до 1/3 клетки. Если гликоген окрашен слабо и занимает меньше 1/4 клетки, считают содержание гликогена недостаточным. У очень молодых дрожжей гликоген отсутствует, при окрашивании раствором иода (раствором Люголя) под микроскопом видны клетки бледно-желтого цвета. Это указывает на то, что дрожжи еще не готовы и их рано передавать на брожение. В перестоявшихся или плохо упитанных дрожжах гликоген отсутствует или содержится в небольшом количестве.
|
|
|
Волютин (метахроматин) – запасной полифосфат в соединении с простыми белками и рибонуклеиновой кислотой. Он является источником фосфора, необходимым для построения АТФ – получения энергии.
Техника определения. Для определения волютина готовят фиксированный препарат. На обезжиренное предметное стекло наносят петлей каплю воды, в нее вносят петлей еле заметное количество биомассы дрожжей или каплю культуральной жидкости, содержащей клетки дрожжей. Содержимое перемешивают и размазывают петлей по поверхности предметного стекла. Полученный мазок высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. Мазок заливают карболовым фуксином Циля и окрашивают 0,5-1 мин. Краску сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают в течение 20-30 с 1 %-ым раствором серной кислоты. Мазок промывают водой, накладывают на него фильтровальную бумагу для удаления излишков влаги. Можно на влажный мазок наложить предварительно протертое от пыли покровное стекло. Далее мазок микроскопируют, используя объектив микроскопа 40х. Зерна метахроматина окрашиваются в красный цвет.
|
|
|
При окраске метиленовой синью (в соотношении 1:10) фиксированных препаратов метахроматиновые зерна окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, протоплазма – в голубой. При последующей обработке препарата 5 %-ым раствором соды метахроматиновые зерна обесцвечиваются, а протоплазма остается окрашенной в голубой цвет. Обработка препарата 1 %-ым раствором серной кислоты приводит к противоположному результату: обесцвечивается протоплазма, а метахроматиновые зерна сохраняют окраску.
Жир – запасное вещество, обнаруживаемое в основном в старых клетках, растущих на богатой питательными веществами среде. Представляет собой триглицериды, и служит резервным источником энергии.
Техника определения. Для определения жира клетки дрожжей окрашивают суданом III или 1 %-ым раствором осмиевой кислоты следующим образом. На предметное стекло наносят (лучше всего петлей) небольшую каплю 40 %-ого раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру дрожжей. Формалин убивает клетки дрожжей и делает клеточную оболочку проницаемой. Через 5 мин добавляют небольшую каплю метиленовой сини, еще через 10 мин каплю свежеприготовленной смеси равных объемов спиртового раствора судана III и воды (можно каплю только спиртового раствора судана III). Препарат накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма окрашивается в синий цвет, гранулы и капельки жира - в розово-оранжевый, вакуоли остаются бесцветными. Раствор судана III готовят на спирте или молочной кислоте: 0.1 г судана III растворяют в 20 мл 96 %-ого спирта или в концентрированной молочной кислоте. Раствор фильтруют через фильтровальную бумагу.
|
|
|
Окрашивание ядра. Техника определения. По методу Романовского-Гимза препарат дрожжей фиксируют 5 мин метанолом или жидкостью Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают спиртом и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной водой (рН 7,2), высушивают и микроскопируют. Ядро окрашивается в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - в слабо-розовый.
По методу Фельгена из суточной культуры приготавливают мазок, высушивают на воздухе и фиксируют парами 2 %-ого раствора осмиевой кислоты в течение 2-3 мин. Для фиксации на дно чашки Петри наносят 2-3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают на маленькие стеклянные палочки мазком вниз. Далее мазок подвергают гидролизу в 1 н. растворе соляной кислоты при температуре 60 оС в течение 2-3 мин, опуская предметное стекло в небольшой химический стакан с соляной кислотой, помещенный в водяную баню. По окончании гидролиза мазок немедленно промывают водой и заливают 1 %-ным раствором формалина на 1,5 мин и вновь промывают водой. Мазок окрашивают 0,1-1,0 %-ым водным раствором основного фуксина 1-2 мин, промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. На розовом фоне цитоплазмы ядро окрашивается в ярко-малиновый цвет.
Окраска митохондрий. Для окраски митохондрий применяют краситель зеленый янус. Слабые водные растворы зеленого януса 1:5000, 1:50000 окрашивают митохондрии прижизненно и субвитально. Окраска зеленым янусом и нейтральным красным (нейтральрот) одновременно выявляет в клетках и митохондрии и метахроматин.
Техника определения. На предметное стекло нанести каплю дрожжевой суспензии, добавить каплю раствора зеленого януса, покрыть покровным стеклом, микроскопировать с использованием объектива микроскопа 40 х.
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 2091; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!