Щелочная фосфатаза.
содержится преимущественно в зрелых нейтрофильных лейкоцитах; активность фермента связывают со вторичными (специфическими) гранулами цитоплазмы. Относится к группе гидролитических ферментов с оптимумом действия при рН 9,6, осуществляет гидролиз однозамещенных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено определение активности фермента методами азосочетания.
Метод азосочетания по Кеплоу.
Принцип. Расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил-фосфата с освобождением а-нафтола, образующего с солями диазония нерастворимый окрашенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента.
Реактивы.
1. 10% раствор формалина в абсолютном метаноле.
2. 0,05 М раствор пропандиолового буфера (рН 9,75); готовят основной 0,2 М раствор (10,5 г 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола растворяют в 500 мл дистиллированной воды), хранят его в холодильнике. Из основного раствора готовят 0,05 М раствор (25 мл основного раствора буфера смешивают с 5 мл 0,1 н. раствора НСI и доводят дистиллированной водой до 100 мл), хранят в холодильнике.
3. а-Нафтилфосфат. Можно использовать нафтол-АS-фосфат, нафтол-АS-TR-фосфат или нафтол-АS-ВI-фосфат.
4. Прочный синий RR; можно использовать отечественные красители диазоль синий 2С и диазоль синий0.
5. 2 % раствор метилового зеленого.
6. Инкубационная среда (готовят перед употреблением): 35 мг а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR, 35 мл буферного раствора.
Специальное оборудование.
Холодильник.
Ход исследования.
Высохшие на воздухе мазки фиксируют в 10 % растворе формалина в абсолютном метаноле при температуре 0—5 °С в течение 30 с. На высохшие мазки наносят инкубационную среду после фильтрования и оставляют мазки при комнатной температуре на 8—10 мин. Ополаскивают в проточной воде в течение 10 с.
Докрашивают метиловым зеленым в течение 15 мин или гематоксилином Майера 3—4 мин.
Дата добавления: 2015-12-17; просмотров: 10; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!