Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.
Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК - положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.
Цитохимическое исследование гликогена.
Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов - шифф-йодная кислота).
Метод Шабадаша. Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.
Посуда и оборудование
* Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.
* Мерные цилиндры.
* Градуированные пипетки.
* Колбы емкостью 250 мл.
* Воронки.
* Горелки.
* Термостат.
* Весы.
Реактивы.
* 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
* Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).
|
|
|
* Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.
* Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.
* 1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).
* 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).
Ход окраски.
* Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.
* Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
* Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
* Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
* Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 - 2 мин).
* Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 - 40 мин (в темноте).
* Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
|
|
|
* Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
* Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.
* Промывают в дистиллированной воде.
Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.
В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.
Дата добавления: 2015-12-17; просмотров: 10; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!