Биологическое обогащение пробы в культуре клеток
Культуры клеток (линии: ВНК-21 - клетки почек однодневного сирийского хомячка; Verо-клетки почек африканской зеленой мартышки; LLС-МК2 - клетки почек макаки резус) используют для биологического накопления в пробе вирусов, риккетсий и хламидий. Учитывая биологические особенности указанных групп возбудителей, исследование проводят раздельно: в отношении вирусов и в отношении риккетсий и хламидий.
Биологическое накопление вирусов
Материалом для заражения культуры клеток служит взвесь пробы из флакона «Д». Эта взвесь перед заражением клеток должна быть выдержана в холодильнике при 2-40С не менее часа (контакт пробы с антибиотиками). Для выявления большинства видов вирусов исследуемым материалом заражают 18 пробирок с монослоем клеток на пластинках.
Методика заражения клеточных культур состоит в следующем:
- удаляют из пробирок с клеточной культурой ростовую среду;
- вносят в пробирки исследуемый материал (инокулят) в объеме 0,2мл;
- выдерживают пробирки в наклоненном положении в течение часа при комнатной температуре (контакт инокулята с клетками);
- полностью удаляют ипокулят из пробирок и однократно отмывают зараженные клетки 1,5 мл солевого раствора Хенкса или поддерживающей среды;
- вносят в пробирки по 1 мл поддерживающей среды. Пробирки с зараженной культурой клеток инкубируют а термостате при температуре 370С в течение 44 (72)ч. Через 24 и 44 (72)ч из пробирок извлекают пластины с монослоем клеток для исследования с помощью МФА (по 9 пластинок на каждом сроке). Отмытые и высушенные пластины приклеивают затем на три предметных стекла (по три пластины на каждом) и фиксируют в охлажденном ацетоне.
|
|
Остающаяся в пробирках после извлечения пластин культуральная жидкость может быть использована при необходимости для постановки РНГА.
Извлечение пластин с монослоем зараженных клеток проводят с соблюдением правил асептики и требований противоэпидемического режима. Для извлечения пластин из пробирок используют длинную пастеровскую пипетку, капилляр которой запаян и изогнут в виде короткого крючка. Извлеченные из пробирок пластины однократно промывают изотоническим раствором хлорида натрия и размещают в наклонном положении (клеточным слоем сверху) на листе фильтровальной бумаги, сложенной в виде «гармошки», и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания клеточного слоя. Высохшие пластины приклеивают одним концом на предметное стекло клеем № 88.
После высыхания клея предметные стекла погружают в охлажденный химически чистый ацетон и фиксируют в нем в течение 15 мин при 2-40С.
|
|
Биологическое накопление риккетсий и хламидий
Материалом для заражения клеточных культур служит взвесь пробы из флакона «г». Эта взвесь перед заражением культуры клеток должна быть выдержана в холодильнике при 2-40С не менее одного часа (контакт пробы с антибиотиками).
Для выявления основных видов риккетсий и хламидий исследуемым материалом заражают 8 пробирок с монослоем клеток на пластинах. Для этого из пробирок с клеточной культурой удаляют ростовую среду, вносят в пробирки исследуемый материал (инокулят) в объеме 0,2мл, инкубируют пробирки в наклонном положении в термостате при температуре 370С в течение 1,5-2 ч (контакт инокулята с клетками), полностью удаляют инокулят из пробирок и однократно промывают зараженные клетки 1,5 мл «разводящей» среды. Вносят в пробирки по 1 мл поддерживающей среды с 2% сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков.
Пробирки с зараженной культурой клеток инкубируют в термостате при температуре 370С в течение двух суток.
Через 24 и 44ч из пробирок извлекают пластины с монослоем клеток для исследования с помощью МФА (по 4 пластины на каждом сроке). Отмытые и высушенные пластины приклеивают на предметное стекло и фиксируют в охлажденном ацетоне.
|
|
Остающуюся в пробирках после извлечения пластин культуральную жидкость используют при необходимости для постановки РНГА.
Методы специфической индикации
Анализ материалов пробы с помощью метода флюоресцирующих антител (МФА)
Метод флюоресцирующих антител, выгодно сочетающий принципы иммунологического и морфологического исследований с люминесцентным анализом, отличается высокой чувствительностью и специфичностью. В основе его лежит реакция между искомым антигеном и люминесцирующим иммуноглобулином, меченым специальными красителями - флюорохромами. Образующийся в результате такой реакции комплекс антиген + флюоресцирующее антитело приобретает способность светиться в синих и ультрафиолетовых лучах спектра.
Основным преимуществом МФА является возможность быстрого выявления, изучения локализации и идентификации возбудителей бактериальных, риккетсиозных, вирусных, грибковых инфекций и их антигенов в препаратах, окрашенных гомологичными флюоресцирующими иммуноглобулинами. МФА в течение 1-2 ч позволяет обнаруживать не только жизнеспособные особи возбудителей, но и мертвые клетки, содержащиеся в препарате.
|
|
Для специфической индикации применяют прямой метод флюоресцирующих антител в сочетании с контрастированием неспецифического свечения. С этой целью для окраски мазков используют смесь, состоящую из равных объемов специфических флюоресцирующих антител, меченных флюоресцеин-изотиоцианатом (излучающим зеленый цвет), и контрастирующего альбумина нормальной сыворотки (лошадиной, бычьей, кроличьей), конъюгированного с родаминовыми красителями (обладающими красной люминесценцией).
Для проведения специфической индикации с помощью прямого МФА необходимы:
- наборы сухих меченных флюоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) иммуноглобулинов;
- сухой сывороточный альбумин, меченный производными родамина;
- химически чистый ацетон или этиловый спирт для фиксации мазков;
- 0,01 М фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4) с 0,87% хлорида натрия для отбывания препаратов в процессе их обработки люминесцирующими иммуноглобулинами;
- дистиллированная вода (нейтральной рН) для растворения сухих люминесцирующих конъюгатов и отмывания окрашенных мазков;
- 0,15 М (изотонический) - раствор хлорида натрия для приготовления рабочих разведении люминесцирующих конъюгатов;
- нелюминесцирующее иммерсионное масло (или диметилфталат) и трис-глицериновая смесь для люминесцентной микроскопии;
- предметные и покровные стекла для приготовления мазков и препаратов для микроскопии;
- батарейные стаканчики для фиксации и отмывки окрашенных препаратов;
- кюветы с крышками (влажные камеры) или чашки Петри для окраски мазков люминесцирующими иммуноглобулинами;
- пробирки, пипетки и прочая посуда для подготовки рабочих разведении люминесцирующих конъюгатов и обработки ими мазков;
- люминесцентный микроскоп с источником питания. До начала работы люминесцирующие иммуноглобулины и контрастирующий альбумин растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы (обычно в 0,5 мл). К использованию пригодны лишь те конъюгаты, которые легко и без осадка растворяются в течение 1-2 мин. Растворенные конъюгаты можно хранить при 2-40С в течение нескольких недель плотно закрытыми.
Окраску мазков производят так называемой рабочей смесью конъюгатов, которую также готовят заблаговременно, но срок ее хранения при 2-40С не должен превышать семи дней.
Важнейшим условием правильного составления рабочей смеси конъюгатов является оптимальный подбор в ней соотношения люминесцирующего иммуноглобулина, меченного ФИТЦ, и альбумина, меченного производными родамина. Это достигается титрованием люминесцирующих конъюгатов на контрольных мазках, содержащих гомологичные люминесцирующим иммуноглобулином микроорганизмы или их антигены (диагностикумы и т. п.).
Прежде всего, определяют красящий титр контрастирующего альбумина (табл. 1). Для этого из исходного раствора люминесцирующего альбумина готовят ряд двукратных разведений на забуференном изотоническом растворе. Затем полученные разведения наносят на мазки и инкубируют стекла с мазками во влажной камере при температуре 370С в течение 30 мин. Далее мазки дважды (каждый раз по 5 мин) отмывают забуференным изотоническим раствором и ополаскивают дистиллированной водой. После высушивания на воздухе мазки подвергают люминесцентной микроскопии.
Таблица 1
Дата добавления: 2021-11-30; просмотров: 17; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!