Пример титрования люминесцирующего альбумина
Препараты | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | Красящий титр | Рабочее разведение |
Мазок-отпечаток с тампона | +++* | +++ | +++ | +++ | ++** | - *** | 1:64 | 1:32 |
Мазок-отпечаток селезенки мыши | +++ | +++ | +++ | ++ | - | - | 1:32 | 1:16 |
Перевиваемые клетки амниона человека | +++ | +++ | +++ | ++ | + **** | - | 1:64 | 1:32 |
* + + + - отчетливо выраженное оранжево-красное или красно-бурое свечение;
** + + - красное свечение различных оттенков;
*** + - серо-желтое (бурое) свечение;
**** - - свечение отсутствует.
За красящий титр альбумина, меченного родамином, принимают то максимальное разведение конъюгата, которое обусловливает оранжево-красное свечение элементов мазка интенсивностью 1-2 креста. Рабочее разведение контрастирующего альбумина в 2 раза концентрированнее его красящего титра.
На следующем этапе определяют красящий титр люминесцирующего иммуноглобулина в присутствии красящего альбумина. Для этого двукратные разведения испытуемого люминесцирующего иммуноглобулина смешивают с равными объемами контрастирующего альбумина, взятого в двойной по сравнению с его рабочим разведением концентрации. Приготовленными смесями окрашивают контрольные мазки, содержащие гомологичные люминесцирующему иммуноглобулину антигены (табл. 2).
Таблица 2
Пример титрования люминесцирующего иммуноглобулина в присутствии альбумина
Препараты | Характерфлюоресценции
| Интенсивность свечения при различных разведениях специфического конъюгата в смеси с альбумином, взятом в рабочем разведении 1 : 16 | Красящийтитрлюминесцирующегоиммуноглобулина | Рабочееразведениеиммуноглобулинавсмесисальбумином | ||||||
1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | ||||||
Мазокизсмыва | Специфическая зеленая | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | + | 1:32 | 1:16 | ||
Неспецифическая красная | + | ++ | ++ | ++ | ++ | |||||
Мазокотпечатокселезенки | Специфическая зеленая | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | ++ | 1:32 | 1:16 | ||
Неспецифическая красная | + | ++ | ++ | ++ | ++ | |||||
Монослойпереживаемыхклетокамнионачеловека | Специфическая зеленая | ++++ | ++++ | ++ | +++ | + | 1:32 | 1:16 | ||
Неспецифическая красная | - | + | ++ | ++ | ++ |
* Красящий титр люминесцирующего иммуноглобулина в этом примере равен 1:32. Однако для окраски мазков специфический конъюгат, как и контрастирующий альбумин, используется в рабочем разведении, которое должно быть в два раза концентрированнее его красящего титра. Следовательно, рабочая смесь конъюгатов, выбранная на основании приведенных в данном примере результатов, должна состоять из разведенного 1:16 специфического люминесцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина, взятого в разведении 1:17. Чтобы получить в рабочей смеси эти оптимальные соотношения, оба конъюгата должны быть разведены 1:8, а затем смешаны в равных объемах.
|
|
Правильно подобранная рабочая смесь должна обеспечивать оранжево-красную флюоресценцию фона препарата (гетерологичных микроорганизмов, клеточных элементов и прочих посторонних примесей) и яркое зеленое специфическое свечение антигена, гомологичного испытуемому люминесцирующему иммуноглобулину.
Для окраски мазков используют полигрупповые, группо- и видоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины.
При исследовании мазков, приготовленных из нативного материала пробы (I и II ступени анализа), рекомендуется следующий порядок окраски.
1. При наличии полигрупповых препаратов вначале окрашивают мазки на 1-м стекле, нанося:
- на 1-й квадрат стекла - полигрупповой бактериальный люминесцирующий иммуноглобулин;
- на 2-й квадрат стекла - полигрупповой риккетсиозный люминесцирующий иммуноглобулин;
- на 3-й и 4-й квадраты - полигрупповые вирусные люминесцирующие иммуноглобулины (два препарата);
- на 5-й квадрат стекла - кокцидиоидозный люминесцирующий иммуноглобулин.
|
|
Если с каким-либо полигрупповым диагностическим препаратом будет получен положительный результат, дополнительной окраске подлежат 2-е или 3-е стекло. При этом мазки 2-го стекла окрашивают видоспецифическими бактериальными люминесцирующими иммуноглобулинами, а мазки 3-го стекла - видо- и группоспецифическими риккетсиозными или вирусными люминесцирующими иммуноглобулинами.
2. Если полигрупповые диагностические препараты отсутствуют то для окраски мазков сразу используют видо- и группоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины:
- для 2-го стекла - к возбудителям чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы (универсальные или антиспоровые), сапа и мелиоидоза;
- для 3-го стекла - к возбудителям эпидемического сыпного тифа, Ку-лихорадки, группы клещевых пятнистых лихорадок, пситтакоза, оспы и кокцидиоидоза.
Резервным стеклом с мазками иммунолюминесцентного анализа остается первое.
Для окраски мазков, приготовленных из взвесей после концентрирования пробы физическими способами (III стадия анализа), в основном используют те же диагностические препараты, что и при исследовании мазков из нативного материала. Отличие состоит лишь в том, что из анализа исключаются вирусные люминесцирующие иммуноглобулины. Кроме того, при целенаправленном исследовании проб воды к числу бактериальных диагностических препаратов в ряде случаев может быть добавлен холерный люминесцирующий иммуноглобулин.
|
|
При окраске пластин с монослоем клеток, зараженных в целях накопления вирусов (IV стадия анализа), рекомендуется следующий порядок.
1. При наличии полигрупповых диагностических препаратов вначале окрашивают пластины 1-го стекла тремя различными полигрупповыми вирусными люминесцирующими иммуноглобулинами. При получении положительного результата с каким-либо полигрупповым препаратом для идентификации обнаруженного вируса дополнительно окрашивают пластины с монослоем клеток на 2-м и 3-м стеклах соответствующими этому полигрупповому препарату видо - и группоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами.
2. Если полигрупповые диагностические препараты отсутствуют, то для окраски пластин с монослоем клеток сразу используют видо- и группоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины:
- для пластин 1-го стекла - к альфавирусам, флавирусам и вирусу натуральной оспы;
- для пластины 2-го стекла - к аренавирусам и вирусам Марбург и Эбола;
- для пластин 3-го стекла - к вирусам конго-крымской геморрагической лихорадки и лихорадки долины Рифт.
Одна пластина 3-го стекла остается резервной на случай необходимости применения какого-либо дополнительного диагностического препарата. Стекла с пластинами, извлеченными на втором сроке, окрашивают в том же порядке.
Для окраски пластин с монослоем клеток, зараженных в целях накопления риккетсий и хламидий (IV стадия анализа), сразу используют видо- и группоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины:
- для 1-й пластины - к риккетсиям эпидемического сыпного тифа;
- для 2-й пластины - к возбудителю Ку-лихорадки;
- для 3-й пластины - к возбудителю пситтакоза.
Стекла с пластинами, извлеченными на втором сроке, окрашивают в том же порядке.
При окраске мазков-отпечатков брюшины и селезенки белых мышей, использованных для биологического обогащения пробы (V стадия анализа), рекомендуется следующий порядок.
1. При наличии полигрупповых люминесцирующих иммуноглобулинов вначале окрашивают мазки на 1-м стекле, нанося:
- на 1-й и 5-й квадраты (т. е. соответственно на отпечатки брюшины и селезенки) полигрупповой бактериальный диагностический препарат;
- на 2-й и 6-й квадраты - полигрупповой риккетсиозный диагностический препарат.
В случае обнаружения в окрашенных мазках бактерий для идентификации последних дополнительно окрашивают соответствующими бактериальными видоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами мазки-отпечатки на 2-м и 3-м стеклах, а в случае обнаружения риккетсий - соответствующими риккетсиозными видо- и группоспецифическими диагностическими препаратами мазки-отпечатки на 4-м стекле.
2. При отсутствии полигрупповых диагностических препаратов для окраски мазков-отпечатков сразу используют видо- и группоспецифические бактериальные и риккетсиозные люминесцирующие иммуноглобулины.
Пятое стекло с отпечатками только селезенки, мышей передают во 2-ю подгруппу идентификации БС, где его окрашивают полигрупповыми люминесцирующими иммуноглобулинами.
Для окраски мазков-отпечатков мозга мышей-сосунков, зараженных в целях накопления вирусов (V стадия анализа), рекомендуется следующий порядок.
1. При наличии полигрупповых вирусных диагностических препаратов вначале окрашивают мазки на 1-м стекле тремя различными полигрупповыми люминесцирующими иммуноглобулинами. В случае получения положительного результата с каким-либо из этих препаратов для идентификации выявленного вируса дополнительно окрашивают мазки-отпечатки на 2-м стекле соответствующими видо- и группоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами.
2. При отсутствии полигрупповых диагностических препаратов окраску сразу проводят видо- и группоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами к альфавирусам, флавирусам, вирусу натуральной оспы, к вирусам Мачупо и Лаоса, вирусу Марбург, вирусу Эбола, к вирусам конго-крымской геморрагической лихорадки и лихорадки долины Рифт.
Окраска мазков и препаратов люминесцирующими иммуноглобулинами
На фиксированные и высушенные мазки и препараты с монослоем клеточной культуры наносят пастеровской пипеткой рабочую смесь специфического люминесцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина. При окраске различными по специфичности люминесцирующими иммуноглобулинами мазков, расположенных на одном предметном стекле, нельзя допускать слияния капель конъюгатов.
Обработку мазков конъюгатами проводят во влажной камере при температуре 370С в течение 20 мин.
По истечении 20 мин стекла с мазками извлекают из влажной камеры, удаляют с поверхности мазков остатки конъюгатов и отмывают мазки для удаления непрореагировавших люминесцирующих иммуноглобулинов.
Отмывку мазков проводят в двух сменах (по 5 мин каждая) 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 7,2-7,4) с 0,87% хлорида натрия, после чего мазки споласкивают дистиллированной водой.
Люминесцентная микроскопия
Для получения правильных результатов люминесцентной микроскопии необходимо до начала исследования тщательно сцентрировать всю осветительную систему микроскопа и подобрать опытным путем оптимальную комбинацию первичных и запирающих светофильтров. При использовании люминесцирующих иммуноглобулинов, меченных ФИТЦ, чаще всего применяют возбуждающие светофильтры СС-4, СС-8 или ФС-1, СЗС-7 в комбинации с запирающим светофильтром типа ЖС-18.
При иммунолюминесцентном исследовании препаратов используют иммерсионные системы. При этом для выявления бактерий, риккетсий и грибов применяют масляную иммерсию (нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат). Для выявления вирусов в препаратах из клеточных культур или в мазках-отпечатках органов животных целесообразно использовать водно-иммерсионные системы.
Нефлюоресцирующее масло (диметилфталат) наносят непосредственно на мазок. При использовании водно-иммерсионной системы на окрашенные препараты предварительно наносят трисглицериновую смесь, затем препарат накрывают покровным стеклом, на которое сверху наносят каплю дистиллированной воды.
Для получения достоверных результатов исследования рекомендуется просматривать под микроскопом не менее 20-25 полей зрения в каждом мазке (если морфологически типичные возбудители встречаются почти в каждом поле зрения, можно ограничиться просмотром меньшего числа полей зрения).
Учет результатов иммунолюминесцентной микроскопии проводят визуально на основе выявления морфологических особенностей и локализации возбудителя, а также оценки интенсивности и специфичности его свечения.
Оценку интенсивности специфической флюоресценции объекта проводят с учетом ее структурных особенностей по следующей схеме:
+ + + + - яркая сверкающая флюоресценция изумрудно-зеленого цвета, четко выявляются морфологические особенности микроорганизма, вокруг корпускулярных агентов может наблюдаться ярко светящийся ободок;
+ + + - яркая флюоресценция зеленого цвета, морфологические особенности микроорганизма выявляются достаточно отчетливо, нередко хорошо видны периферические ободки;
+ + - слабая . флюоресценция желтовато-зеленого цвета, морфологические особенности микроорганизмов выявляются еще достаточно четко, периферические ободки почти не видны;
+ - очень слабая флюоресценция неопределенного цвета, микроорганизмы различаются с трудом;
- - флюоресценция объекта отсутствует.
Результаты иммунолюминесцентного анализа считаются положительными, если в препарате обнаруживаются, хотя бы единичные (для мелких бактерий и риккетсий - не менее 10 особей), морфологически типичные микроорганизмы или пораженные вирусом (риккетсиями, хламидиями) тканевые клетки (не менее 3-5 в препарате), специфически флюоресцирующие на 3-4 креста при отрицательных контролях.
При исследовании любого неизвестного материала основным контролем специфичности являются все остальные мазки данной пробы, которые оказались окрашенными гетерологичными по отношению к выявленному в пробе агенту люминесцирующими иммуноглобулинами. Наряду с этим иммунолюминесцентный анализ должен сопровождаться микроскопией и других препаратов, приготовленных из несодержащих микроорганизмы материалов (например, незараженные клеточные культуры, отпечатки органов здоровых животных и т.п.) и окрашенных теми же специфическими люминесцирующими иммуноглобулинами. Этот контроль обязателен, прежде всего, при вирусологических исследованиях и может быть общим для всех проб на данный срок анализа.
При соблюдении всех необходимых условий приготовления и окраски таких препаратов специфическая зеленая флюоресценция во всех контрольных мазках должна полностью отсутствовать.
Дата добавления: 2021-11-30; просмотров: 13; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!