Анализ материалов пробы с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)
Для выявления содержащихся в пробе микроорганизмов, их антигенов и бактериальных токсинов применяют реакцию непрямой гемагглютинации с использованием иммуноглобулиновых эритроцитарных диагностикумов.
Для постановки реакции необходимо иметь:
- эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум;
- иммунную сыворотку для контроля специфичности РНГА;
- изотонический раствор хлорида натрия;
- ингредиенты для приготовления разводящей жидкости (лошадиную или кроличью нормальную сыворотку).
Сухой эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностикум и гомологичный иммуноглобулин (иммунную сыворотку), а также ингредиенты для приготовления разводящей жидкости растворяют и подготавливают к реакции в точном соответствии с наставлением по применению данного диагностического препарата.
В зависимости от характера жидкой фазы пробы исследуемый материал либо сразу используют в реакции, либо подвергают предварительной дополнительной обработке. В частности, в суспензии, приготовленные из органов и тканей животных, членистоногих, патологического материала, полученного от больных, а также в кровь и другие биологические жидкости добавляют равный объем насыщенного раствора хлорида натрия (для устранения возможных неспецифических реакций). С этой же целью культуральную среду из пробирок с зараженной клеточной культурой разводят в два раза изотоническим раствором хлорида натрия. К пробам воды добавляют 9% раствор хлорида натрия в соотношении 1 : 10.
|
|
|
Постановка реакции. Исследуемый материал разливают по 0,025 мл в два параллельных ряда лунок панели микротитратора с таким расчетом, чтобы на каждый определяемый антиген приходилось по две лунки. Лунки первого ряда являются опытными, второго-контрольными. В лунки второго ряда для контроля специфичности реакции добавляют по 0,025 мл специфических иммуноглобулинов (иммунные сыворотки) соответствующих эритроцитарным диагностикумам. В лунки первого ряда (для уравновешивания объемов в опытных и контрольных лунках) вносят по 0,025 мл разводящей жидкости.
Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по углам панели.
Через 10 мин в первые лунки (опытную и контрольную) вносят по 0,025 мл 1 % взвеси соответствующего иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума. Панели после перемешивания содержимого в лунках оставляют стоять при комнатной температуре 1-1,5 ч до полного осаждения эритроцитов.
Помимо контроля специфичности реакция сопровождается еще двумя контролями диагностикума:
- на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов (в две лунки вносят по 0,05 мл разводящей жидкости и по 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного диагностикума);
|
|
|
- на отсутствие неспецифической агглютинации эритроцитов в иммунной сыворотке (в две лунки вносят по 0,025мл разводящей жидкости, 0,025 мл иммунной сыворотки и 0,025 мл 1% взвеси эритроцитарного диагностикума).
Учет реакции начинают с контролей. Характер осадков эритроцитов оценивают по 4-крестовой шкале:
++++ - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол;
+++ - по окружности равномерна агглютинировавших эритроцитов отмечается тонкое («фестончатое») кольцо;
++ - на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается кольцо меньшего диаметра с более ровным краем;
+ - четкое кольцо малого диаметра на слаборазличимом фоне агглютинировавших эритроцитов;
- - агглютинация эритроцитов отсутствует, на дне лунки образуется маленькое кольцо с четким ровным краем или компактный диск.
Реакцию учитывают только при отсутствии гемагглютинации в контролях диагностикума. РНГА считают положительной, если в лунках с исследуемым материалом имеется гемагглютинация не менее чем на 3 креста при отсутствии таковой в тех лунках, куда был добавлен иммуноглобулин. РНГА считают отрицательной, если во всех лунках гемагглютинация отсутствует.
При наличии гемагглютинации как в опытной, так и контрольной лунке, реакцию следует повторить с разведением исследуемого материала 1:5 и 1:10. Если и в этом случае эритроциты также будут агглютинировать во всех лунках, реакцию считают неспецифической и ее результаты не учитывают.
Дата добавления: 2021-11-30; просмотров: 24; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!