Бактериологическое исследование

     Материал для исследования. Свежие трупы мелких животных и птиц целиком, трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, отрезки тонкого и толстого отделов кишечника, перевязанные с двух сторон, мезентериальные и под­челюстные лимфоузлы, корень языка, миндалины.

С целью прижизненной диагностики используют фекалии. При наличии в фекалиях примеси крови, слизи, гноя, пленок для исследования отбирают именно такие пробы. Наибольшие шансы на выделение возбудителя име­ются, если материал отбирают в период острого течения болезни при повы­шенной температуре тела.

 

    Микроскопическое исследование исходного материала. Из поступившего материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Иерсиний являются грамотрицательными прямыми палочками с закругленными концами, иногда имеют вид коккобактерий. Диаметр клеток 0,5-0,8 мкм, длина от 0,8-1,2 до 2,0-3,0 мкм.

        

  Выделение и идентификация культур иерсиний

Культивирование. Возбудители псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза являются фа­культативными анаэробами, обладающими и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Хемоорганотрофы. Оптимальная температура куль­тивирования 22-28° С, но размножаться они способны при температурах от 2 до 40° С. Диапазон рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН 7,4-7,6.

  Иерсиний хорошо растут на дезоксихолатном агаре, средах Мак-Кон­ки, Эндо, Серова, СБТС. Среда Плоскирева и висмут-сульфит агар обла­дают выраженным ингибирующим действием на иерсиний обоих видов. Оба возбудителя способны расти на голодных средах (голодно-кислый агар, фосфатно-буферный раствор и др.).

Высеву исследуемого материала на питательные среды обычно предше­ствует его обогащение, позволяющее повысить эффективность выделения культур иерсиний.

   Общепризнанным методом обогащения материала при исследованиях на иерсиниозы является метод холодового обогащения, основанный на спо­собности иерсиний размножаться в питательных субстратах при низких плю­совых температурах. Большинство других микроорганизмов, включая и энтеробактерии иных родов, такой способностью не обладает. Способность Y . enterocolitica u Y . pseudotuberculosis расти на голодных средах и исполь­зование в силу этого фосфатно-буферного раствора в качестве среды обо­гащения, придают методу дополнительную эффективность.

Исследуемый материал массой не менее 20 г растирают в ступках. Из­мельченные пробы вносят в пробирки со стерильной средой обогащения (фосфатно-буферный раствор) в соотношении 1:5. Пробирки помещают в холодильник при температуре 4° С. Начиная со вторых-третьих суток хра­нения из пробирок начинают делать ежедневно (до получения положитель­ных результатов, но не более 15 суток хранения) высевы на среду Эндо или среду с индикатором бромтимоловым синим (СБТС), являющуюся диффе­ренциально-диагностической для выделения возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Существенным недостатком классического метода холодового обога­щения является его длительность (до 15 суток), из-за чего бактериологичес­кие исследования в ряде случаев затягиваются до 28 суток. Устранить этот недостаток позволяют рекомендуемые для выделения и идентификации чи­стой культуры Y . enterocolitica экспресс-методы, предусматривающие ис­пользование «холодового удара», «теплового удара» и «щелочной обра­ботки».

  При применении метода «холодового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в холодильную камеру при температуре минус 18° С на 18 часов. Затем материал оттаивают и делают из него высевы на среды Эндо или СБТС.

При использовании метода «теплового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в термостат при 42° С на 18 часов. После этого про­изводят посевы на среды Эндо или СБТС.

Для метода «щелочной обработки» предварительно готовят 40%-ный раствор едкого кали на стерильной дистиллированной воде и хранят его в холодильнике. Перед проведением исследований из 40%-ного раство­ра готовят 0,5%-ный раствор едкого кали на стерильном 0,5%-ном ра­створе натрия хлорида. Для этого в стерильных условиях смешивают 7,9 мл 0,5%-ного раствора натрия хлорида с 0,1 мл 40%-ного раствора едкого кали.

Приготовленный таким образом раствор щелочи разливают по 0,2 мл в лунки полистироловой пластины и вносят в них 0,2 мл исследуемого мате­риала в среде обогащения. Смесь тщательно перемешивают. Выдержива­ют в течение 3-5 мин и делают высевы в бульон Хоттингера. Посевы инку­бируют при 37° С в течение суток и делают из них высевы в чашки со среда­ми Эндо или СБТС.

Помимо фосфатно-буферного раствора в качестве сред обогащения могут быть использованы буферно-казеиново-дрожжевая среда, 1%-ная забуферная пептонная вода, 1%-ная пептонная вода с добавлением К₂НРО₄.

  Исследуемый материал с жидких сред обогащения высевают на среду Эндо или СБТС петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. Посевы инкубиру­ют при 22-25° С в течение 18-24 час (на СБТС — в течение 48 час). По истечении этого срока посевы просматривают и характерные для иерсиний колонии пересевают на слабощелочной МПА или агар Хоттингера. Посе­вы инкубируют при 22-25° С в течение суток. Из типичных изолирован­ных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Из тех же колоний делают высевы на питательный бульон для определения оксидазной активности. Посевы инкубируют при 22-25° С в течение су­ток. В бульонные культуры добавляют 0,2 мл оснафтола и 0,3 мл диметилпарафенилендиамина, содержимое пробирок перемешивают. При наличии оксидазы в течение 30 сек происходит окрашивание бульона в фиолетовый цвет. Дальнейшему изучению подлежат только грамотрицательные, не об­разующие оксидазу культуры (сем. Enterobacteriaceae). Такие культуры высевают на среду Клиглера и среду с мочевиной по Кристенсену. Для дальнейшего изучения отбирают культуры, не образующие сероводород (оранжево-красный цвет среды Клиглера не изменяется в черный после 24 час инкубирования посевов), обладающие уреазной активностью (красно-ма­линовое окрашивание среды Кристенсена в течение 1-4 суток инкубиро­вания посевов).

 

Характер роста иерсиний на питательных средах. На плотных питательных средах при 4-28° С оба возбудителя в аэробных условиях образуют колонии S-формы. На агаре Хоттингера и МПА через 18-24 часа образуются круглые с ровными краями, полупрозрач­ные, блестящие колонии с голубоватым оттенком, мягкой консистенцией и диаметром 0,5-1,0 мм. На агаре Эндо колонии круглые, выпуклые, блес­тящие с ровными краями, бесцветные со слегка розоватым оттенком, диа­метром от 0,1 до 1,0 мм.

На СБТС агаре через 48 часов на сине-голубом фоне среды образуются голубые колонии с фестончатым краем, выпуклым центром и суховатой матовой поверхностью, диаметром 1,5-2,0 мм. При взятии петлей они сдви­гаются по поверхности агара. Иногда (особенно у возбудителя псевдоту­беркулеза) виден светло-голубой ободок по краю колонии. Колонии дру­гих энтеробактерий, не разлагающих мочевину (эшерихии, сальмонеллы и др.), изменяют окраску среды, приобретая желтый цвет и характерную мор­фологию (сочные, выпуклые). В жидких средах (МПБ, бульон Хоттингера) образуют равномерное помутнение.

При температурах культивирования свыше 28° С микроорганизмы обо­их видов диссоциируют в R-форму. При этом на плотных питательных средах, наряду с описанными выше колониями S-формы, появляются ко­лонии с выраженным полиморфизмом по размеру, форме, цвету (особенно при температуре 37° С и выше). Чаще всего R-формы колоний имеют буг ристую поверхность, неправильную форму, неровные изрезанные края, коричнево-желтоватый цвет. Нередко они имеют суховатую консистен­цию. В жидких средах R-формы образуют помутнение и хлопьевидный осадок либо осадок и рыхлую поверхностную пленку с прозрачной надо-садочной жидкостью.

 

  Морфология иерсиний в культуре. В мазках из культур возбудители обоих видов представляют собой грамотрицательные овоидные палочки или коккобактерии размером 0,5- 0,8x1,0-3,0 мкм. Спор и капсул не образуют. Y . enterocolitica чаще распо­лагается в мазках поодиночно, но может образовывать и цепочки различ­ной длинны. Y . pseudotuberculosis цепочки образует чаще, а также может окрашиваться биполярно.

   Иерсиний обоих видов подвижны при температуре ниже 30° С (подвиж­ность выражена максимально при 20-22° С) за счет перитрихиально рас­положенных жгутиков и неподвижны при 37° С. У Y . enterocolitica подвиж­ность обычно выражена в большей степени, чем у Y . pseudotuberculosis.

 

  Идентификация иерсиний по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для иер­синий культуральными, морфологическими и тинкториальными свойства­ми относят к роду Yersinia на основании изучения их ферментативных свойств. К иерсиниям относят штаммы микроорганизмов, не об­ладающие оксидазной активностью, не образующие сероводород, уреазопозитивные, дающие положительную реакцию с метиловым-красным, от­рицательную реакцию Фогес-Проскауэра (при 37° С), не растущие на сре­де Симмонса, не образующие лизиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, подвижные при 4-28° С и неподвижные при 37-42° С, не ферменти­рующие лактозу и ферментирующие с образованием кислоты маниит, L-арабинозу. Ни Y . pseudotuberculosis, ни Y . enterocolitica не растут в при­сутствии KCN.При дифференциации Y . enterocolitica и Y . pseudotuberculosis следует иметь в виду, что Y . pseudotuberculosis не ферментирует лактозу, сахаро­зу, раффинозу, целлобиозу, дульцит, инозит, сорбит, инулин и D-арабинозу, но ферментируют с образованием кислоты глюкозу, галактозу, L-арабинозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, трегалозу, маинит и салицин; редуцируют нитраты, метиловый синий; вступают в реакцию с метиловым красным; образуют каталазу; обладают уреаз-ной активностью; не образуют ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауера при температурах 25 и 37° С.

  Y . enterocolitica не ферментируют лактозу (есть лактозоположительные варианты, часто среди сероваров 05 и 07,8), рамнозу, раффинозу; не обла­дают фенилаланиндезаминазой, лизиндекарбоксилазой и аргининдегидролазой. Реакция Фогес-Проскауэра положительная при температуре 25° С и отрицательная при 37° С.

Другие 8 видов рода Yersinia, а именно: Y . aldovae , Y . kristensenii , Y . frederiksenii , Y . rohdei , Y . mollaretii , Y . bercovieri , Y . intermedia , Yruckeri мо­гут находиться в испражнениях людей, животных и в смывах с предметов ок­ружающей среды. Они так же, как Y . enterocolitica и Y . pseudotuberculosis хоро­шо растут на питательных средах для выделения иерсиний. Тесты, позволяю­щие дифференцировать Y . pseudotuberculosis, 5 биоваров Y . enterocolitica от других часто встречающихся видов иерсиний, представлены в таблице 16.

Таблица 16  - Основные биохимические свойства

Y . pseudotuberculosis и Y. enterocolitica , отличающие их от других

видов рода Yersinia

 

Тест		Y. enterocolitica					Y. frederi ksenii	Y. inter­media	Y.kris tensenii	Y. aldo-vae
	Y.pseudotuberculo­sis	Биовары
		I	I I	III	IV	V
Лактоза 37° С	-	+	-	-	-	-	d	d	-	-
Мальтоза 37° С	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-
Сахароза 37° С	-	+	+	+	+	d	+	+	-	-
Фогес-Проскауер 37° С	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Фогес-Проскауер 25° С	-	+	+	+	+	+	+	+	-	+
Рамноза 25° С	+	-	-	-	-	-	+	+	-	+
Цитрат Сим­монса 37° С	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Цитрат  Сим­монса 25° С	-	-	-	-	-	-	d	-	-	d
Индол	-	+	+	-	-	-	+	+	d	-
Ксилоза 37° С	+	+	+	+	-	-	+	+	d	d
Салицин 37° С	d	+	-	-	-	-	+	+	d	-
Сорбит 37° С	-	+	+	+	+	-	+	+	+	+
Трегалоза 37° С	+	+	+	+	+	-	+	+	+	-

Обозначения:«+»— признак положительный; «—» — признак отрицательный; «d» — признак варьирует у различных штаммов.

 

Возбудитель псевдотуберкулеза по ряду свойств сходен с возбудите­лем чумы (Y . pestis ) и в ряде случаев, главным образом при исследовании материала от грызунов (особенно в природных очагах чумы), когда посе­вы из органов производят непосредственно на плотные питательные среды, может возникнуть необходимость дифференциации этих возбудите­лей. Основные отличительные признаки Y . pseudotuberculosis и Y . pestis представлены в таблице 17.

Таблица 17 - Свойства и дифференциация Y . pestis и Y . pseudotuberculosis

 

Тест или свойство	Реакция
	Y. pestis	Y. pscudotubcrculosis
Подвижность при 37° С	-	-
Подвижность при 25° С	-	+
Гидролиз мочевины	-	+
Ферментация адонита	-	+
Ферментация L-рамнозы	-	+
Ферментация мслибиозы	-	+
Чувствительность к фагу при 37° С	+	d
Чувствительность к фагу при 25° С	+	-
Реакция с антисывороткой к фракции 1 Y.pestis	+	-
Продукция коагулазы	+	-
Продукция фибринолизина	+	-
Патогснность для мышей	+	+
Патогснность для белых крыс	+	-
Патогснность для морских свинок	+	+
Патогснность для кроликов	-	-

  

Наиболее ценными для дифференциации этих возбудителей являются тесты, характеризующие их отношение к мочевине, подвижность, наличие фибринолизина и плазмокоагулазы. Кроме того, следует учитывать непри­хотливость к питательным средам Y . pseudotuberculosis и отсутствие поли­морфизма у колоний Y . pestis , который обычно растет на специальных сре­дах, и при 28° С на вторые сутки образует колонии только R-формы. При подозрении на выделение Y . pestis дальнейшую идентификацию проводят в специализированных учреждениях.

  Культуры, отнесенные к видам Y . enterocolitica и Y . pseudotuberculosis , подвергают серологической идентификации в реакции агглютинации на стекле. Завершающим этапом является определение патогенных свойств выделенных штаммов иерсиний.

 

Серологическая индикация и идентификация иерсиний. Y . enterocolitica имеют соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены. У вирулентных штаммов обнаруживаются V- и W-антигены, расположенные в наружной мембране клетки. У отдельных штаммов имеется антиген К1, связанный с фимбриями и разрушающийся только автоклавированием при 120° С в течение часа (Ющенко Г.В., 1985).

О-антигены возбудителя кишечного иерсиниоза являются полисахари­дами, устойчивыми к нагреванию и действию этанола. Согласно классифи­кации Winbland—Wauters по О-антигену различают более 60 сероваров Y . enterocolitica , которые обозначают арабскими цифрами 1,2 и т.д. Часть сероваров имеет разделение на субсеровары, обозначаемые буквами a, b и т.д. Также буквами обозначают и жгутиковый термолабильный антиген, разрушающийся при кипячении.

Наиболее распространенными среди животных и людей являются серова­ры: Ol, 2a,3; 02a, 2b,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 09; О10; 013,7; 014; 015; 018; 019,8; О20; 021 и 022.

Y . enterocolitica серовара О3 распространены на всех континентах. Ча­стота их обнаружения на территории России составляет от 15 до 60% и более. Далее следуют серовары 04,32 и 05,27 (10-50%), 07,8 (5-10%) и 09 (1-30%). Другие из названных сероваров встречаются значительно реже.

Y . pseudotuberculosis имеют жгутиковый антиген (Н), 2 соматических (О) антигена S и R, антигены вирулентности — V и W, расположенные в наруж­ной мембране и выраженные при температуре культивирования иерсиний 37° С. Н-антиген образуется при температуре 18-20° С, термолабилен и не имеет диагностического значения. R-антиген является общим для всех псев­дотуберкулезных бактерий, а также и для Y . pestis . Обнаружена общность этого антигена с сальмонеллами групп В и D. По S-антигену различают 8 сероваров Y . pseudotuberculosis , обозначаемых римскими цифрами (I-VIII). Большая часть штаммов, выделенных на территории России, как и в дру­гих странах, от животных, человека, из объектов внешней среды, относит­ся к серовару I (60-90%). На втором месте по частоте обнаружения нахо­дится серовар III (10-30%). Серовары II, IV, V обнаруживают в 2-8% случаев. О циркуляции в нашей стране Y . pseudotuberculosis сероваров VI, VII и VIIIсведений нет.

   Антигенные связи Y . pseudotuberculosis и большинства сероваров Y . enterocolitica слабые и выявляются лишь иммунно-диффузионными мето­дами. Более значительные антигенные взаимодействия, проявляющиеся в традиционной РА, имеют место у возбудителя псевдотуберкулеза серовара I с культурами Y . enterocolitica сероваров 08; 018 и 021.

Оба возбудителя имеют общий антиген с энтеробактериями других видов, за счет чего могут быть получены положительные реакции с сы­воротками к некоторым представителям этого семейства. У Y . pseudotuberculosis установлены антигенные связи с сальмонеллами шигеллами и эшерихиями, у Y . enterocolitica — с сальмонеллами, проте­ями, серрациями, гафниями, клебсиеллами. Особо следует отметить на­личие антигенного родства у серовара 09 с представителями рода Brucella. 

В связи с этим в благополучных по бруцеллезу хозяйствах не­редко выявляются неспецифические реакции с бруцеллезным диагностикумом, обусловленные инфицированием крупного рогатого скота Y . enterocolitica. Возбудитель кишечного иерсиниоза имеет антигенное родство с холерным вибрионом и возбудите­лем туляремии. С Y . pestis близкие антигенные связи и постоянные перекрестные положи­тельные результаты реакций имеет возбудитель псевдотуберкулеза. Y . enterocolitica не имеет антигенных связей с Y . pestis .

Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по био­химическим свойствам к видам Y . pseudotuberculosis и Y . enterocolitica . Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками к наиболее распространенным сероварам иерсиний. Наборы, выпускаемые для этих целей (Санкт-Петербургский институт им. Пастера), включают сыворотку, поливалентную к I-V сероварам, и сыворотки, моновалентные к I и III сероварам Y . pseudotuberculosis , а также сыворотки к сероварам: 03; 04,32; 04,33; 05,27; 05; 06,30; 07,8; 08; 09 и 013,7 Y . enterocolitica .

Реакция агглютинации ставится по общепринятой методике. С этой целью из флакона пастеровской пипеткой набирают сыворотку, не захва­тывая при этом осадка со дна флакона. Каплю сыворотки наносят на пред­метное стекло и тщательно растирают в ней петлю 20-24-часовой агаро­вой культуры испытуемого штамма. После получения гомогенной суспен­зии стекло покачивают осторожными круговыми движениями. Положи­тельная реакция (агглютинация) наступает сразу или не позднее 2-3 мин в виде склеивания бактериальной массы с образованием плотных, с тру­дом разбивающихся зернышек. Жидкость при этом полностью или час­тично просветляется.

  При отрицательной реакции смесь сыворотки и бактериальной массы остается в виде равномерной гомогенной взвеси.

   В последние годы разработан и успешно апробирован ряд методов ди­агностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, направленных на обнаружение возбудителей или их антигенов в патологическом материале от павших животных, а также в копрофильтратах и моче больных живот­ных с подозрением на псевдотуберкулез и иерсиниоз.

 

   Иммуноферментный анализ (ИФА) . В последнее десятилетие установлена прямая зависимость между степе­нью выраженности вирулентных свойств Y . pseudotuberculosis и концентра­цией антигенов вирулентности в наружней мембране. Показано, что для реализации адгезии возбудителя к эпителию слизистой оболочки кишечни­ка с последующей инвазией и размножением в эпителии и макрофагах необ­ходима экспрессия белков наружной мембраны (БНМ) — антигенов виру­лентности. Данное обстоятельство делает перспективным использование БНМ с диагностическими целями.

В настоящее время разработано и апробировано 3 варианта тест-систем для ИФА, направленного на обнаружение БНМ иерсиний:

   ИФА-ЛПС — псевдотуберкулезная система с широким спектром при­менения как для диагностики псевдотуберкулеза, так и для решения эпиде­миологических вопросов. Чувствительность метода —10⁵ микробных кле­ток в 1 см³ пробы, что соответствует 100 мкг/мл липополисахарида возбу­дителя. Эффективность метода 70,2-81,1% ;

     ИФА-БНМ-1 — тест-система для ранней диагностики псевдотубер­кулеза. Обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять воз­будителя в органах и тканях животных, копрофильтратах и моче. Она наиболее эффективна при исследовании материала в начальный пери­од болезни, когда антигены обнаруживают в 69-84% проб копрофиль-тратов и в 21-38% проб мочи. Чувствительность метода 10^s-5х10⁵ микробных клеток в 1 см³;

   ИФА-БНМ-П — тест-система для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в материалах от больных (копрофильтраты, моча), павших и вынужденно убитых животных.

Для определения видовой принадлежности выявленных иерсиний (анти­генов возбудителя) пробы, давшие положительную реакцию в тест-системе ИФА-БНМ-П, проверяют в тест-системе ИФА-ЛПС для выявления возбу­дителя (антигенов) псевдотуберкулеза.

Чувствительность метода — 10⁵ микробных клеток в 1 см³, эффектив­ность — до 83,6% положительных проб при исследовании копрофильтра-тов в первые 5 дней болезни. На пике инфекционного процесса данным методом выявляют до 70% инфицированных животных.

   Для исследования материала в тест-системе ИФА-БНМ-П копрофильтраты, выпот брюшной полости вносят в фосфатно-буферную или буферно-казеиново-дрожжевую среду в количестве 1 г на 5 см³ среды для подращи­вания при температуре 3-7° С. Внутренние органы и ткани растирают с этими средами в ступке (соотношение 1:5). Образцы исследуют в первые сутки получения проб и затем на 3-5-е сутки от начала подращивания. Мочу исследуют в нативном виде.

Результаты учитывают визуально или спектрофотометрически. В пер­вом случае реакцию оценивают в крестах по интенсивности появляющего­ся коричневого окрашивания в лунках. Положительной считают реакцию с пробой, которая дала реакцию не менее чем на ++, и по интенсивности окраски существенно отличается от проб отрицательного контроля (К -, оцененные как «—» или «+»). Положительные результаты должны быть и в пробе с положительным контролем (К +).

  При спектрофотометрическом учете результатов содержимое лунок с отрицательным контрольным образцом (К-) используют в качестве нуле­вого контроля. Измерение оптической плотности проводят при длине вол­ны 450 нм и считают результат положительным, если коэффициент погло­щения светового потока исследуемого образца достигает величины не ме­нее 0,05.

Наборы компонентов для постановки всех трех вариантов ИФА разра­ботаны Санкт-Петербургским институтом эпидемиологии и микробиоло­гии им. Пастера. Каждый из компонентов рассчитан на проведение 192 анализов, включая контроли.

 Реакция коагглютинации (РКА). Для постановки РКА пробы мочи и копрофильтратов (с подращиванием и без него) прогревают в водяной бане в течение 30-40 мин, центрифугиру­ют, фильтруют и исследуют надосадочную жидкость. Сыворотку крови ис­следуют в нативном состоянии.

На предметное стекло, разделенное на необходимое число секторов, наносят капли исследуемого материала. В каждую из капель исследуемого образца добавляют по 1 капле коагглютинирующих диагностикумов раз­личных видов и сероваров иерсиний, в последнюю каплю вносят взвесь несенсибилизированных стафилококков (отрицательный контроль). В ка­честве положительного контроля на отдельном предметном стекле смеши­вают по 1 капле каждого использованного диагностикума с 1 каплей липополисахарида соответствующих бактерий в концентрации 10-20 мкг/см³. Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская сли­яния проб, расположенных рядом. Результат реакции учитывают через 5-30 минут экспозиции стекол во влажной камере по образованию хлопьев агглютината стафилококков и просветлению жидкости.

  РКА наиболее эффективна в начальный период острого заболевания (1-5-й дни), при других формах — в сроки максимальной выраженности клинических признаков.

По данным различных авторов чувствительность данного мето­да исследований составляет 10⁵-10⁸ микробных клеток/см³. Эффек­тивность при кишечном иерсиниозе — до 85%, при псевдотуберку­лезе — до 60-70% в первые 5 дней от начала болезни. В отличие от РА при постановке РКА не наблюдается перекрестных реакций с другими представителями энтеробактерий, бруцеллами. Использо­вание РКА сокращает сроки исследования на иерсиниоз с 14-17 до 3-4 суток в сравнении с традиционным бактериологическим иссле­дованием.

 

Реакция латекс-агглютинации (РИА). РИА используют для выявления антигенов возбудителей псевдотубер­кулеза и кишечного иерсиниоза в копрофильтратах и в смывах с объектов внешней среды. В отличие от РКА, в качестве носителей иммуноглобули­нов используют частицы латекса, которые не обладают антигенностью, а потому предпочтительнее стафилококка. Латексный псевдотуберкулезный диагностикум выпускается Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сыворо­ток. Сконструированы латексные диагностикумы и для индикации Y . enterocolitica сероваров О3; О5, 30; О7,8.

Чувствительность метода — 10⁶ микробных клеток в 1 см³ исследуемой пробы. Диагноз на псевдотуберкулез данным методом может быть подтвер­жден у 73% больных животных.

Большинство штаммов Y . enterocolitica , выделяемых на территории Рос­сийской Федерации от животных, человека и из объектов внешней среды, относятся к сероварам О3; О9; О5, 27; О8; О6, 30. В Европе преобладают бактерии сероваров О3 и О9, в США — О8, на Дальнем Востоке — О6.

   В многочисленных работах, посвященных изучению иерсиниозов у жи­вотных, сообщается, что практически на всех территориях от свиней изоли­руют Y . enterocolitica сероваров О3; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 07; 08; 09; 011;012;017 и 019,а иерсиний, выделенные от крупного рогатого скота, относятся к сероварам О3; 04; 05,27; 07,8; 012; 013 и 018.

 

       Определение патогенности Y . pseudotuberculosis являются безусловно патогенными микроорганиз­мами. У них, в отличие от Y . enterocolitica , отсутствует зависимость виру­лентности от наличия плазмиды, контролирующей синтез V- и W-антигенов и кальцийзависимость роста, поскольку бесплазмидные варианты сохраня­ют инвазивные и цитотоксические свойства. Это указывает на определяю­щую роль хромосомного контроля основных патогенных свойств Y . pseudotuberculosis . Поэтому выделение чистой культуры, отнесение ее к виду Y . pseudotuberculosis и определенному его серовару являются доста­точными основаниями для постановки диагноза на псевдотуберкулез. Од­нако и в этом случае иногда прибегают к постановке биопробы. С этой целью ставят кератоконъюнктивальную пробу (тест Шереня) на морских свинках. При этом в один из конъюнктивальных мешков животного инокулируют каплю суспензии испытуемого штамма концентрацией 10¹⁰ микроб­ных тел. При положительном результате в течение 48-72 час развивается гиперемия конъюнктивы, отек век и сужение глазной щели, наблюдают серозно-гнойное истечение.

Возможно использование для постановки биопробы и белых мышей, ко­торых заражают орально, внутривенно или внутрибрюшинно. В зависимо­сти от метода инокуляции псевдотуберкулезного возбудителя, животные погибают на 3 -9-е сутки. На вскрытии обнаруживают увеличение печени и селезенки, которые имеют многочисленные некротические очажки, напо­минающие туберкулезные бугорки, но в отличие от них, не подвергающие­ся обызвествлению. Аналогичные абсцессы или узелки обнаруживают и в легких.

К безусловно патогенным Y . enterocolitica относятся бактерии сероваров 03; 04, 32; 05; 05, 27; 06, 30; 07,8; 08; 09 биоваров IIи IV, реже I и III.Наряду с ними выделяется и значительная часть апатогенных иерсиний. При этом принадлежность того или иного штамма к опреде­ленному серологическому и биологическому варианту далеко не всегда подтверждает либо опровергает его этиологическую значимость. Име­ется достаточно сообщений о выделении патогенных штаммов иерсиний серо-биоваров, ранее считавшихся непатогенными, и наоборот. Из-за столь неоднозначной роли различных серобиоваров Y . enterocolitica в патологии животных для правильного решения вопроса о патогенности того или иного штамма, а следовательно, и для правильной постановки диагноза необходимы дополнительные исследования его факторов вирулентности.

Для большинства патогенных штаммов Y . enterocolitica характерны вы­раженные адгезивные свойства, обусловливающие колонизацию возбуди­теля на энтероцитах, а также энтеротоксигенность. Продуцируемый возбу­дителем в больших количествах термостабильный энтеротоксин весьма сходен с таковым энтеротоксигенных неинвазивных эшерихий.

Механизм действия термостабильного энтеротоксина Y . enterocolitica связан с активацией аденилатциклазы в эпителиальных клетках кишечни­ка, что ведет к накоплению циклического гуанозинмонофосфата и наруше­нию водноэлектролитного баланса и энтеросорбции. В реализации дей­ствия энтеротоксина принимают участие и простоглаидины. Наблюдаемая при этом колонизация энтероцитов при минимальной инвазии или ее отсут­ствии подтверждает важную роль энтеротоксина в патогенезе кишечного иерсиниоза. Энтеротоксигенные Y . enterocolitica вызывают у животных и человека диареи различной интенсивности.

Штаммы Y . enterocolitica , обладающие инвазивностью, способностью размножаться в органах и тканях организма хозяина, вызывают генерализованную инфекцию. Корреляции между эптеротоксигенностью и инвазив­ностью у данного возбудителя не установлено.

В отличие от Y . enterocolitica , у Y . pseudotuberculosis установлены мак­симальная инвазивность, цитотоксичиость и способность к генерализа­ции инфекции. Действие энтеротоксина Y . pseudotuberculosis на слизис­тую оболочку кишечника выражено значительно меньше, чем у Y . enter ocolitica .

К настоящему времени установлено, что к возбудителю кишечного иер­синиоза чувствительны некоторые лабораторные животные.

  Rokovsky (1973) сообщает, что гибель морских свинок наблюдается при внутрибрюшном их заражении патогенными иерсиниями в дозе 3х10⁹ мик­робных клеток в течение 24-48 часов. К подкожному введению возбуди­теля животные оказались устойчивы.

   А.Б. Дайтерун и соавт. (1987) удалось вызвать у морских свинок конъ­юнктивит, а в ряде случаев абортивный кератит при введении патогенных иерсиний серовара 09 в конъюнктивальную полость. При этом штаммы серовара ОЗ патологической реакции не вызвали.

В опытах Lee et al. (1980) показано, что пероральное заражение кроль­чат (массой 1,0-1,3 кг) или взрослых особей (массой 2,0-3,0 кг) ведет к развитию профузной диареи и последующей гибели животных. Для зараже­ния использовали адгезивный, но неинвазивный штамм серовара О3. Ин­фицирующая доза составляла 2,9x10⁸ микробных клеток.

Многие авторы сообщают о чувствительности к пато­генным иерсиниям белых мышей.

Лучшими способами заражения являются внутрибрюшное и подкожное введение бактерий. При этих способах аппликации иерсиний в разных опы­тах и для различных сероваров (О3; 08; 09; 06,30) ЛД₅₀ возбудителя со­ставляли от 1,5х10⁷ до 2,5х10⁸ микробных клеток.

   При пероральном заражении мышей инфекционный процесс удавалось воспроизвести только при искусственном подавлении иммунитета (бестимусные животные, обработка иммунодепрессантами) либо на мышах-гнотобиотах.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что патогенность Y . enterocolitica для лабораторных животных изучена еще недостаточно. До­полнительную сложность в изучении данного вопроса вызывает циркуляция в природе патогенных иерсиний с различной степенью вирулентности для жи­вотных, включая и лабораторных. Вследствие этого нередко при заражении патогенными иерсиниями лабораторных животных их гибели не наблюдается, поэтому биопроба для проверки патогенности Y . enterocolitica не рекомендует­ся.

Выше упоминалось о том, что патогенность у Y . enterocolitica детерми­нируется плазмидой и сопровождается наличием у таких штаммов ряда культуральных особенностей, которые предложено использовать в качестве мар­керов вирулентности.

 

   Определение способности к аутоагглютинации. Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жид­кой питательной среде и заключается в спонтанном склеивании клеток иерсиний. Для проверки данной способности в две пробирки со средой Кларка засевают чистую культуру испытуемого штамма Y . enterocolitica , получен­ную на МПА. Посевной материал вносят в количестве 10⁶-10⁸ микробных клеток в объеме 1 см³. Одну из пробирок инкубируют при температуре 37° С, вторую — при 25° С в течение 24-48 часов.

Патогенные иерсинии при температуре культивирования 37° С образу­ют обильный хлопьевидный осадок, а при 25° С — равномерное помутне­ние, при этом возможен небольшой, компактный осадок.

Непатогенные бактерии в обеих пробирках дают рост в виде равномер­ного помутнения при отсутствии хлопьев.

При длительном лабораторном хранении штаммов с частыми пересева­ми и культивированием при 37° С часть изначально патогенных клеток, составляющих популяцию изучаемого штамма, может утрачивать плазмиду, отвечающую за вирулентность. При наличии в популяции 30-70% та­ких бесплазмидных клеток результаты теста становятся нечеткими. В та­ких случаях его повторяют после предварительного клонирования с целью выделения плазмидосодержащих клонов. Данную операцию можно осуще­ствить при определении кальцийзависимости роста изучаемого штамма, что также относится к одному из маркеров вирулентности у данного вида бактерий.

  Определение кальцийзависимости роста. Данный тест основан на том, что у патогенных иерсинии при культиви­ровании их на кальцийдефицитной агаровой среде при температуре 37° С проявляется ограничение роста. Это выражается образованием колоний значительно меньшего диаметра, чем при культивировании на обычных питательных средах или при дефиците ионов Са ++, но при температуре 25° С.

Для определения кальцийзависимости готовят специальную кальцийдефицитную среду на основе коммерческого агара АГВ. На поверхность этой среды в двух чашках Петри засевают культуру испытуемого штамма, выра­щенную в среде Кларка при 25° С. Посев ведут с тем расчетом, чтобы полу­чить рост изолированных колоний (от 100 до 500 клеток на стандартную чашку Петри). Одну чашку инкубируют при 37° С, вторую — при 25° С в течение 48 часов, после чего учитывают результаты теста.

Патогенные иерсинии при 37° С вырастают в виде колоний значитель­но меньшего диаметра, чем на чашке, инкубировавшейся при 25° С. Иногда рост может отсутствовать вовсе. Дополнительное инкубирование та­кой чашки при 25° С в течение 24-48 часов ведет к образованию коло­ний обычного размера.

Непатогенные иерсинии при обеих температурах образуют колонии обычной величины (через 24 часа диаметром 1,0-1,5 мм, через 48 часов — до 1,5-2,0 мм).

При наличии в популяции патогенных иерсинии клеток, утративших плазмиду, детерминирующую факторы патогенности, рост при 37° С отме­чают в виде различного соотношения крупных и мелких колоний.

 

   Определение температурозависимой морфологии колоний . Морфологию колоний иерсинии изучают после их 24-48-часового ин­кубирования при 25° С и 37° С на агаре АГВ в чашках Петри.

Учет результатов осуществляют невооруженным глазом или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют окуляр-микрометром.

При 37° С патогенные иерсинии образуют малопрозрачные, желтовато­го цвета, зернистые, выпуклые колонии, диаметр которых, как правило, не превышает 1,0 мм.

При 25° С колонии патогенных штаммов сходны по морфологии и размерам с колониями, образуемыми непатогенными иерсиниями при обеих температурах инкубирования. Они более прозрачны, голубова­того цвета, плоские, маслянистой консистенции, имеют диаметр в 1,5- 3 раза больший, чем у патогенных иерсинии, вырастающих при 37° С.

 

Определение пиразинамидазной активности. Тест основан на способности непатогенных Y . enterocolitica продуцировать пиразинамидазу и отсутствии такой способности у патогенных штаммов.

Для выполнения теста готовят специальную плотную питательную сре­ду с пиразинкарбоксиамидом. В пробирку со скошенной питательной сре­дой высевают культуру испытуемого штамма и инкубируют посевы в тече­ние 48 часов при 25-30° С. По окончании инкубирования на поверхность среды с выросшими колониями наносят 1%-ный водный свежеприготовлен­ный раствор железистого сульфата аммония. Учет результатов теста про­водят через 15 минут.

  Колонии непатогенных иерсинии, продуцирующих пиразинамидазу, при­обретают розовую окраску, патогенных — не изменяют своего цвета.

 

  Серологическая идентификация вирулентных иерсинии в реакции агглютинации на стекле (РА-СВИ) . Вирулентные иерсинии выявляют с помощью диагностической сыворот­ки к вирулентным иерсиниям (СВИ) в РА на стекле.

Комплект для РА с сывороткой диагностической к вирулентным иер­синиям (СВИ) содержит СВИ с рабочим разведением 1:10 и 10 %-ную нормальную кроличью сыворотку («К-» для контроля специфичнос­ти).

Для постановки реакции на обезжиренное предметное стекло наносят 1 каплю СВИ и 1 каплю «К -». В обе капли добавляют по одной петле куль­туры испытуемого штамма, выращенной на МПА при 25-37° С, и расти­рают биомассу до образования гомогенной суспензии. Затем стекло осто­рожно покачивают, наблюдая за результатом реакции.

Положительная РА вирулентных иерсиний с СВИ характеризуется по­явлением крошек агглютината в течение 3 минут. Агглютинат лучше заме­тен на темном фоне при косом освещении. В суспензии с нормальной сыво­роткой («К-») агглютинат образовываться не должен.

При отрицательной реакции в обеих каплях сохраняется равномерная, гомогенная суспензия бактерий.

---

Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 211; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!