Плотных дифференциальных средах

Среда	Дифференцирующие компоненты	Индикатор	Цвет колоний в зависимости от
			Ферментации углеводов		Образования сероводорода
			+	-	+	-
Плоскирева	Лактоза	Нейтральный красный	Розовый, красный	Бесцветный
Висмут-сульфат	Глюкоза, сульфит висмута	Сульфат железа			Черный, зеленый	Бесцветный
Левина	Лактоза	Эозин, метиленовый синий	Темно-синий, черный с металлическим блеском	Бесцветный
Эндо	Лактоза	Основной фуксин	Красный с металлическим блеском	Бесцветный
Мак-конки	Лактоза	Нейтральный красный	Розовый, красный	Бесцветный

   

 

Дифференциация некоторых родов энтеробактерий

При дифференциации родов энтеробактерий ключевое значение имеет изу­чение биохимических и физиологических свойств, являющихся генетичес­ки более стабильными (табл. 3). Кроме сред Гисса с соответствующими индикаторами и реактивами, для идентификации энтеробактерий могут быть использованы различные диагностические системы, позволяющие сокра­тить и упростить исследования. Так, системы индикаторные бумажные (СИБ), представляющие собой диски или полоски хроматографической бумаги с необходимыми субстратами и индикаторами, а также диски из фотопленки с желатином, выпускаются в виде двух наборов (изготовитель — предприятие по производству бактерийных препаратов Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии). Набор «А» (малый) предназначен для межродовой дифференциации энтеробактерий по 9 основным биохими­ческим свойствам: утилизации цитрата натрия, малоната натрия, фермен­тации лактозы, наличию (β-галактозидазы, фенилаланиндезаминазы, уреазы, лизиндекарбоксилазы, образование индола, сероводорода (табл. 4).

Системы мультимикротестов для идентификации микроорганизмов се­мейства Enterobacteriaceae, выпускаемые НПО «Алерген» (г. Ставрополь), включают два набора. Набор ММТ Е1 позволяет определить 12 ключевых ферментативных свойств энтеробактерий: образование сероводорода, ин­дола, наличие лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, фе­нилаланиндезаминазы, утилизацию цитрата натрия, малоната натрия, маннита, сахарозы, лактозы, сорбита. Набор ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с 12 клю­чевыми свойствами служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие аргининдегидролазы, бетта-галактозидазы, нитратредуктазы, ути­лизация инозита, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раф­финозы, салицина, глюкозы.

После изучения биохимических и физиологических свойств культур зак­лючительным этапом анализа является серологическая идентификация. Ан­тигены и антигенная структура сальмонелл, эшерихий, отчасти протея и клебсиелл изучены достаточно глубоко. Менее известна антигенная струк­тура иерсиний.

Из числа известных антигенов энтеробактерий значение для серологи­ческой идентификации имеют три: О-, К- и Н-антигены.

   О-антиген (соматический) расположен в клеточной стенке бактерий. Он представляет собой липополисахаридо-протеиновый комплекс. Липид свя­зан с токсигенностью, протеин обусловливает иммуногенность, полисаха­рид является компонентом, определяющим антигенную специфичность.

 

Таблица 3 - Основные дифференцирующие признаки

Некоторых родов и видов семейства Enterobacteriaceae

 

Признаки	Escherichia	Salmo­nella	Yer­sinia	Kleb­siella pneu­monia	Mor-ganella	Pro­teus	Serratia marces- cens	Hafnia
Образование индола	+	-	Р	-	+	P	-	-
Проба с метиленовым красным	+	+	+	X	+	+	X	X
Реакция Фогес-Проскауера	-	-	-	+	-	P	+	X
Цитрат (среда Симмонса)	-	+	-	+	-	P	+	-
Образование H2S	-	+	-	-	-	P	-	-
Гидролиз мочевины	-	-	Р	+	+	+	X	-
Лизиндекарбоксилаза	+	+	Р	+	-	-	+	+
Фенилаланиндезаминаза	-	-	-	-	+	+	-	-
Орнитиндекарбоксилаза	X	+	Р	-	+	P	+	+
Подвижность	+	+	+*	-	+	+	+	+
Образование кислоты из:
лактозы	+	-	Р	+	-	-	-	-
маннита	+	+	+	+	-	-	+	+

Обозначения: «-» — 0—10% штаммов положительные; «х» — признак варьи­рует у различных штаммов; «+» — штаммов положительные; «р» — признак различен в разных видах рода; «+*» — подвижны при температуре ниже 30° С.

 

О-антиген устойчив к физико-химическим воздействиям. Выдерживает нагревание при 120° С в течение 2-2,5 часов, сохраняя основные антиген­ные свойства. На него не оказывают действия спирт, 0,5%-ный раствор формалина, нормальный раствор хлористоводородной кислоты (N HC1) и некоторые другие химические вещества.

  Полноценный О-антиген характерен для S-форм (гладких) бактерий. По­явление S => R мутаций затрудняет серологическую идентификацию энтеробактерий, а иногда делает ее невозможной.

К-антигены (оболочечные) являются кислыми полисахаридами. Располо­жены более поверхностно, чем О-антигены, вследствие чего иногда полнос­тью их экранируют. Последнее может явиться причиной инагтлютинабельности живых К+ (плюс) бактерий в О-сыворотках (например, эшерихий).

К-антигены серологически обособлены и не дают перекрестных реак­ций. Они менее устойчивы к воздействиям различных факторов и являются неоднородными в этом отношении. В зависимости от свойств, устойчивости к химическим факторам и термоустойчивости К-антигены обозначают как А-, В-, L-, М- и Vi-антигены.

Н-антигены (жгутиковые) имеют белковую природу (флагеллин). Энтеробактерии являются перитрихами (жгутики расположены по всей поверх­ности клетки). В ряде случаев Н-антигены могут иметь фазовые вариации. Н-антигены термолабильны. Обработка 0,5-1%-ным раствором формали­на не влияет на антигенные свойства Н-антигенов.

  Характерные для каждого рода особенности О-, К- и Н-антигенов и антигенная структура бактерий представлены в соответствующих разде­лах. На основании данных об антигенной структуре энтеробактерий про­водят их серологическую идентификацию.

 

Таблица 4- Определение рода энтеробактерий по тестам СИБ

 

Тест или субстрат	Роды энтеробактерий
	Escher ichia	Edvard siela	Citro-bacter	Salmo­nella	Schig-ella	Kleb­siella	Entero-bacter	Haf­nia	Serra­tia	Pro­teus
Лактоза	+/х	-	+/-	P	P	P	+	-	-	-
Р-галактозидаза	+	-	+	P	P	+	+	+	+	-
Цитрат натрия	-	-	+	+	-	P	+	+	+	P
Малонат натрия	-	-	P	P	-	P	+	P	-	-
Мочевина	-	-	+	-	-	P	P	-	-	P
Фенил аланин	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
Лизин	+	+	-	+	-	P	P	+	+	P
Н2S и подвиж­ность	- +/-	+ +	P +	+ +	- -	- -	- +	- +	- +	P +
Индол	+	+	P	+	P	P	-	-	-	P

 

Обозначения: «+» — положительная реакция; «-» — отрицательная реакция; «х» — реакция с запозданием и не всегда положительная; «Р» — реакция различна у разных видов рода; «р» — реакция различна у разных штаммов или сероваров.

 

 

Питательные среды

    Консервирующие смеси используют при отсутствии необходимых усло­вий и сред для посева в течение 3-4 ч с момента взятия материала. Обычно объем консервирующей смеси должен составлять ²/₃ от объема материала, взятого для исследования.

Глицериновая смесь.Смешивают 1000 см³ изотонического раствора хло­рида натрия и 500 см³ глицерина, затем добавляют 20%-ный раствор на­трия фосфорнокислого (Na₂HP0₄) в таком количестве, чтобы рН смеси со­ответствовал 7,8-8,0. Смесь стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.

Фосфатная буферная смесь. В 1000 см³ дистиллированной воды раство­ряют 0,45 г калия фосфата однозамещенного (КН₂НР0₄) и 5,34 г натрия фосфата двузамещенного (Na₂HP0₄). Стерилизуют 30 мин при 121° С.

Боратно-буфериый раствор.Смешивают 57 г кристаллической буры, 84 г борной кислоты, 99 г натрия хлорида. Затем 20 г полученной смеси растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды. Стерилизуют 10 мин при 121° С.

 

Среды обогащения

Желчный бульон.Применяют в качестве среды обогащения для сальмо­нелл, выделяемых из крови или материалов, не содержащих или содержа­щих в незначительных количествах другие виды бактерий.

  Желчь крупного рогатого скота наливают в колбу и нагревают 1 ч те­кучим паром. После отстаивания фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. К 800 см³ МПБ добавляют 200 см³ желчи, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.

Среда Мюллера.Используют для накопления сальмонелл.

К 4,5 г простерилизованного сухим жаром химически чистого мела (СаС0₃) добавляют 90 см³ МПБ или бульона Хоттингера и стерилизуют 30 мин при 121 ° С. Перед посевом к бульону асептически добавляют 2 см³ ра­створа Люголя (калия иодид — 25 г, йод кристаллический — 20 г, вода дистиллированная — до 100 см³) и 10 см³ раствора натрия тиосульфата (на­трия тиосульфат — 50 г, вода дистиллированная до 100 см³). Смесь переме­шивают и разливают по пробиркам.

Среда Кауфмана. Используют для накопления сальмонелл.

К 100 см³ стерильной среды Мюллера асептически добавляют 5 см³ сте­рильной желчи (желчь стерилизуют дробно, текучим паром 3 дня подряд по 20 мин) и 5 см³ 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Раз­ливают по пробиркам. Не стерилизуют.

Среда Киллиана.Используют для накопления сальмонелл.

К 100 см³ стерильного МПБ или бульона Хоттингера (рН 6,7-6,9) не­посредственно перед применением добавляют 1 см³ 0,1%-ного водного ра­створа бриллиантового зеленого.

Селенитовая среда.Используют для накопления сальмонелл. Для при­готовления используют два раствора. Раствор 1. К 950 см³ раствора фосфатов (натрия гидрофосфат без­водный — 7 г, натрия дигидрофосфат безводный — 3 г) на дистиллиро­ванной воде добавляют 5 г пептона и 4 г лактозы. Разливают во флако­ны по 50 см³ и стерилизуют текучим паром 2 дня подряд по 30 мин или 30 мин при 112° С. При приготовлении раствора количественное соотно­шение фосфатов подтитровывают так, чтобы при добавлении пептона и натрия селенита готовая среда имела рН 6,9-7,1. Раствор хранят при 4-10° С 1-2мес.

Раствор 2. В 40 см³ стерильной дистиллированной воды растворяют 4 г натрия гидроселенита (NaHSe0₃). Раствор готовят непосредственно перед приготовлением среды.

В каждый флакон с 50 см³ раствора 1 асептически добавляют 2 см³ ра­створа 2, перемешивают и разливают по пробиркам.

Магниевая среда. Используют для накопления сальмонелл. Для приго­товления используют два раствора. Раствор 1. К 890 см³ дистиллированной воды добавляют 4,2 г пептона, 7,15 г натрия хлорида, 1,43 г калия дигидрофосфата (KH₂PO₄ и 9 см³ дрож­жевого автолизата.

Раствор 2. В 90 см³ дистиллированной воды растворяют 35,7 г магния хлорида (MgCl₂ х 6Н₂0). Растворы смешивают и добавляют 0,9 см³ 0,5%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С.

Среда Минка.Используют для накопления эшерихий, обладающих ад­гезивными антигенами. Раствор 1 (фосфатный буферный раствор рН 7,5). Берут 1,36 г калия фосфорнокислого однозамещенного (КН,Р0₄), 10,1 г натрия фосфорнокис­лого двузамещенного (Na₂HP0₄ x 7Н₂0) и растворяют в дистиллирован­ной воде до конечного объема 1000 см³. Стерилизуют 30 мин при 115° С.

Раствор 2.10 г магния сульфата (MgS0₄ x 7Н₂0), 1 г марганца хлорида (МnС1₂ х 4Н₂0), 0,135 г железа хлорного (FeCl₃ x 6Н₂0) и 0,4 г кальция хлорида (СаС1₂ х Н₂0) растворяют в дистиллированной воде до конечного объема 1000 см³. Стерилизуют 30 мин при 115° С.

Раствор 3.5 см³ гидролизата лактальбумина (или ферментативного казеиново-дрожжевого гидролизата) растворяют в 100 см³ дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.

Раствор 4.5 г глюкозы растворяют в 100 см³ дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.

Раствор 5.26 г агара «Дифко» растворяют в 100 см³ дистиллированной воды. Стерилизуют 30 мин при 115° С.

Приготовленные растворы асептически соединяют в следующем соот­ношении: раствор 1-500 см³; раствор 2-1 см³; раствор 3-20 см³; раствор 4-20 см³; раствор 5-460 см³ при 50° С.

Среда Ющенко -Дунаева. Используют для накопления иерсиний. В 990 см³ дистиллированной воды растворяют 8,5 г натрия хлорида, до­бавляют 3 см³1/15 М раствора натрия гидрофосфата (Na₂HP0₄ x 12Н₂0) и 7 см³ 1/15 М раствора калия дигидрофосфата (КН₂Р0₄). Устанавливают рН 7,2, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют 10 мин при 116° С или 30 мин текучим паром.

СБТС агар.Используют для выделения возбудителей псевдотуберкуле­за и кишечного иерсиниоза. Выпускается в сухом виде. В 1000 см³ дистиллированной воды вносят указанное на этикетке количество сухой питательной среды и кипятят на медленном огне 5 мин. Охлаждают до 45-50° С и разливают по чашкам Петри. Готовая среда прозрачная, сине-зеленого цвета.

Среда ЭТ-1.Используют для накопления сальмонелл. К 1000 см³ МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4-7,6) добавляют 2 г глюкозы и 2 см³ 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Смесь кипятят на водяной бане 15-20 мин, добавляют 25 000 ЕД полимиксина и асептически разливают по пробиркам. Для приготовления 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты 0,5 г розоловой кислоты растворяют в 10 см³ спирта-ректификата, после чего добавляют 90 см³ дистиллированной воды.

Среда П-1.Используют для накопления протеев. В 1000 см³ стерильного бульона Хоттингера растворяют 1 г манита, 5 г желчных солей по Олькеницкому, 0,8 г калия дигидрофосфата (КН₂Р0₄), 20 см³ 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета. Кипятят в водяной бане 15-20 мин. Добавляют 10 см³ 50%-ного водного раствора мочевины и 1 000 000 ЕД полимиксина. Асептически разливают по пробиркам.

Для приготовления желчных солей по Олькеницкому к 1000 см³ бычьей или свиной желчи добавляют 40 г натрия гидроокиси и автоклавируют 3 ч при 1,5 атм. Добавляют 100 см³ 20%-ного раствора бария хлорида (ВаС1₂ х 2Н₂0), автоклавируют 1 ч при 100° С и оставляют на 12-18 ч при комнат­ной температуре. Над осадочную жидкость сливают, фильтруют и добавля­ют 20%-ный раствор соляной кислоты (до кислой реакции), оставляют на 12-16 ч при комнатной температуре. После этого сливают, промывают водой и добавляют 40%-ный раствор натрия гидроокиси (до щелочной ре­акции). Полученный раствор солей высушивают при 115° С.

Среда К-1.Используют как селективную и для накопле­ния клебсиелл. В 1000 см³ стерильной дистиллированной воды растворяют 5 г на­трия хлорида, 0,2 г магния сульфата (MgS0₄ x 7Н₂0), 2 г калия дигидро­фосфата (КН₂Р0₄), 2 г калия гидрофосфата (К₂НР0₄), 2 г раффинозы, 2 см³ 1,6%- ного щелочного раствора бромтимолового синего, 20 см³ 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета. Кипятят 15-20 мин на водяной бане, добавляют 4 см³ 50%-ного раствора мочевины и асепти­чески разливают по пробиркам.

Для приготовления 1,6%-ного щелочного раствора бромтимолового си­него в 80 см³ дистиллированной воды растворяют 1,6 г бромтимолового синего, 20 см³ 0,25 Н раствора натрия гидроокиси.

Среда Эндо. Селективная среда для энтеробактерий. Выпускается в су­хом виде. Состоит из агара, основного фуксина, натрия сульфата, натрия фосфата, лактозы. Для посевов используют свежеприготовленную среду. В 100 см³ дистиллированной воды растворяют 5 г сухой среды, кипятят при постоянном перемешивании 2-3 мин и разливают по чашкам Петри. Для предотвращения образования большого количества конденсата среду пос­ле кипячения охлаждают до 50° С. Готовая среда имеет розовый цвет. Ко­лонии лактозоположительных бактерий красные, лактозоотрицательных — бесцветные или слегка розоватые.

Среда Левина.Селективная среда для энтеробактерий. К 100 см³ расплавленного и охлажденного до 60-70° С 2%-ного агара Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 2 см³ 0,5%-ного водного раствора ме-тиленового синего (подогретого на водяной бане до 60-70° С), 1,5 см³ 2%-ного раствора эозина, 2 г лактозы и 0,2 г калия фосфорнокислого двуос­новного (КН₂Р0₄). Перемешивают, разливают по чашкам Петри и подсу­шивают. Перед добавлением в среду раствора красителей стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Готовая среда имеет фиолетовый цвет. Колонии эшерихий синего или черного цвета, сальмонелл — бесцвет­ные или розовые, протея — оранжевые, с измененным цветом среды вокруг колонии.

Агар Мак-Конки (таурохолевыйагар).Селективная среда для энтеро­бактерий. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 20 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2,5 г натрия таурохолата, 10 г лактозы, 0,1 г нейтрального крас­ного, 20 г агара. Смесь стерилизуют 20 мин при 121° С.

Агар Плоскирева.Селективная среда для сальмонелл. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара с желчными солями, натрия цитрата, натрия тиосульфата, натрия фосфата, лактозы, нейтрального крас­ного, бриллиантового зеленого, соды кальцинированной, йода, натрия хло­рида. Готовая среда прозрачная или розовато-желтого цвета. Лактозоположительные штаммы сальмонелл образуют колониии красного цвета, лактозоотрицательные штаммы — бесцветные.

Висмут-сульфит агар. Селективная среда для сальмонелл. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара, гидролизата рыбы, глю­козы, висмута цитрата, натрия сульфита, соли Мора, натрия фосфата, бри-лиантового зеленого. Готовая среда имеет зеленоватую окраску. Штаммы сальмонелл, продуцирующие сероводород, образуют черные колони с про­крашиванием агара под колонией в черный цвет. Штаммы сальмонелл, не продуцирующие сероводород, образуют бесцветные или зеленовато-корич­невые колонии.

Среда Рапопорта. Селективная среда для сальмонелл. Состав: МПБ или бульон Хоттингера — 900 см³, желчь бычья — 100 см³, глюкоза — 20 г, индикатор Андреде — 10 см³. Ингредиенты смешивают, разливают по 50 см³ во флаконы с поплавка­ми. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.

Среда Ворфеля -Фергюсона. Используют для лучшего образования кап­сулы у клебсиелл. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 2 г натрия хлорида, 1 г калия сульфата (K₂S0₄), 0,25 г магния сульфата (Mg S0₄ x 7H₂0), 20 г саха­розы, 88 см³ дрожжевого экстракта (или 2 г сухого дрожжевого экстракта), фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам и стерилизу­ют 15 мин при 121° С.

Бульон с 0,2% глюкозы. Используют для лучшего образования капсулы у клебсиелл. Берут 1000 см³ МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,2-7,4). В неболь­шом его объеме, нагретом до 40-50° С, растворяют 2 г глюкозы и смеши­вают с оставшимся бульоном. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С.

 

  Дифференциально-диагностические среды

Среда Штерна. Используют для дифференциации сальмонелл. К 1000 см³ МПБ или бульона Хоттингера добавляют 2,5 см³10%-ного насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 16,6 см³10%-ного водного раствора натрия сульфита (Na₂S0₄) и 10 см³ глицерина. Разлива­ют по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 112° С. Готовая среда имеет желтую окраску. Если испытуемая культура относится к S . typhimurium , которая способна ферментировать глицерин, то среда приобретает фиоле­товый оттенок.

Среда Биттера. Используют для дифференциации сальмонелл. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 0,05 г пептона, 0,5 г на­трия цитрата, 5 г натрия хлорида, 5 г рамнозы (или арабинозы). Кипятят на водяной бане 3-5 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С или текучим паром 3 дня под­ряд по 30 мин. Если испытуемая культура относится к сальмонеллам, спо­собным ферментировать рамнозу или арабинозу ( S . typhimurium ), то при добавлении к суточной культуре (выращенной на данной среде) 2 капель 0,5%-ного спиртового раствора метилового красного среда приобретает красную окраску.

Среда для посева по Свену -Гарду.Используют для выявления у саль­монелл специфической фазы жгутикового антигена. К 1000 см³ МПБ или бульона Хоттингера добавляют 8 г агара и раство­ряют путем кипячения на водяной бане. Устанавливают рН 7,2-7,4, филь­труют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 121° С.

Среды с аминокислотами.Используют для определения способности энтеробактерий в анаэробных условиях расщеплять левовращающие ами­нокислоты — лизин, орнитин, аргинин. В 600 см³ дистиллированной воды растворяют 5 г пептона и 1 г глюкозы, устанавливают рН 6,0-6,1. Приготовленный раствор разливают по 150 см³ в четыре колбы. В каждую из трех колб вносят по 10 г одной из аминокислот. Четвертая колба остается в качестве контрольной. Содержимое всех колб кипятят на водяной бане 5-10 мин, устанавливают рН 6,0-6,1. Во все че тыре колбы вносят по 0,6 см³ 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезоло-вого пурпурного или бромтимолового синего и по 5 см³ 0,1%-ного спиртово­го раствора крезолового красного. Разливают в агглютинационные пробир­ки по 2-3 см³ и стерилизуют 30 мин при 110° С.

   Для проведения теста в пробирки, содержащие аминокислоту, и в конт­рольную пробирку засевают испытуемую культуру, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом (слоем толщиной 10 мм) и инкубируют. Учет проводят в течение 4 сут. При положительной реакции среды с амино­кислотами приобретают фиолетовую или синюю (в зависимости от индика­тора) окраску, в контрольных пробирках среда имеет желтую окраску.

Состав 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезолового пурпурного: бромкрезоловый пурпурный — 1,6 г, спирт этиловый 96° — 100 см³.

Состав 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного: крезоловый красный — 0,1 г, спирт этиловый 96° — 100 см³.

Среды, содержащие органические кислоты.Используют для дифферен­циации сальмонелл по их способности расщеплять органические кислоты (тартраты, мукаты, натрия цитрат). В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, добавля­ют 8,5 см³ 0,1 Н раствора натрия гидроокиси, 12 см³ 0,25-ного водного ра­створа бромтимолового синего, 10 г D-тартрата (или одну из следующих кислот: 5 г L-тартрата, 5 г мезотартрата, 10 г муката, 10 г натрия цитра­та). Устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки и стерилизуют 20 мин при 112° С. Готовая среда синезеленого цвета. При положительной реакции в процессе инкубации среда с культурой приобретает зелено-желтую окраску.

Для получения более четких результатов в конце срока инкубации в пробирки с сомнительной или отрицательной реакцией добавляют несколь­ко капель насыщенного раствора ацетата свинца, в результате при отрица­тельной реакции выпадает обильный осадок (до ²/₃ объема среды), при по­ложительной — выпавший осадок незначителен.

Среда с триптофаном.Используют для определения у бактерий нали­чия триптофандезаминазы. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 2 г DL-триптофана. Устанавливают рН 6,7-6,9. Для определения способности бактерий к дезаминированию триптофана испытуемую агаровую культуру бакте­риологической петлей вносят в пробирку с 0,5 см³ раствора триптофана и инкубируют 30 мин при 37° С, после чего вносят 1 каплю 10%-ного водного раствора железа хлористого трехвалентного (FeCl₃). При поло­жительной реакции среда приобретает темно-красную окраску, при от­рицательной — желтую.

Среда с калием цианидом.В 1000 см³ дистиллированной воды раство­ряют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,225 г калия дигидрофосфата (КН₂Р0₄), 5,64 г натрия гидрофосфата (Na₂HP0₄). Устанавливают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 112° С. Пос­ле стерилизации быстро охлаждают. Среду этого состава используют в качестве контрольной. Непосредственно перед применением к 100 см³ сре­ды асептически добавляют 1,5 см³ свежеприготовленного 0,5%-ного вод­ного раствора калия цианида (KCN), разливают по пробиркам и закры­вают корковыми пробками.

Пробу считают положительной, если через 24-48 ч после посева куль­туры в среде заметно помутнение или опалесценция. При отрицательном результате среда остается абсолютно прозрачной, в то время как в конт­рольной пробирке заметно помутнение.

Среда Клиглер.Используют для определения образования сероводорода. В 1000 см³ МПБ растворяют при кипячении 20 г пептона, 5 г натрия хло­рида, 0,4 г натрия сульфида, 0,08 г натрия тиосульфата, 20 г агара. Устанав­ливают рН 7,8, затем снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 0,5 г железа сернокислого, растворенного в небольшом количе­стве воды, 10 г лактозы, 1 г глюкозы и 12 см³ 0,2%-ного раствора фенолрота в 50%-ном спирте. Среду разливают по 6-7 см³ в пробирки и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среда имеет оранжево-красную окраску. При образовании сероводорода среда окрашивается в черный цвет.

Среда Кларка.Используется для постановки реакции Фогес-Проскауэра и пробы с метиловым красным для определения окисления глюкозы с образованием 2-кетоглюконата. В 100 см³ дистиллированной воды растворяют 0,5 г калия гидрофосфа­та (К₂НР0₄), 0,7 г пептона, 0,5 г глюкозы. Кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 111 ° С.

Реакцией Фогес-Проскауэра выявляют промежуточный продукт рас­щепления глюкозы — ацетилметилкарбинол (ацетоин). Для этого испытуе­мую культуру выращивают на среде Кларка 4-5 дней в 2 пробирках. Одну пробирку культивируют при 25° С, другую при 37° С. Из обеих пробирок по 1 см³ культуры переносят в другие пробирки и добавляют 0,6 см³ 5%-ного спиртового раствора а-нафтола, смесь перемешивают. Затем добав­ляют 0,2 см³.40%-ного водного раствора КОН. Тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч.

Учет реакции проводят через 15 и 60 мин. Положительная реакция — вишневое окрашивание среды.

Тестом с метиловым красным устанавливают снижение рН среды при расщеплении глюкозы до 4,4-6,0. Раствор метилового красного готовят добавлением к 0,1 г метилрота 300 см³ 95%-ного этанола. После растворения красителя добавляют 200 см³ дистиллированной воды.

Для постановки теста в пробирку с 5 см³ среды Кларка вносят петлю испытуемой культуры и инкубируют 2-5 сут при 25° С. Затем добавляют 5-6 капель реактива метиловый красный и следят за изменением окраски. При положительном результате (рН 4,0-6,0) среда приобретает красный цвет. При отрицательном результате (рН 6,0-7,0) среда приобретает жел­тый цвет.

Среда с мочевиной по Кристенсену.Используют для определения спо­собности бактерий к гидролизу мочевины (уреазная активность) с образо­ванием аммиака и углекислоты. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2 г калия дигидрофосфата (КН₂Р0₄), 20 г агара. Смесь стерилизу­ют 20 мин при 115° С. Затем вносят 1 г глюкозы и 6 см³ 0,2%-ного раствора фенилрота, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50° С и асептичес­ки добавляют 100 см³ 20%-ного водного раствора мочевины, стерилизован­ного фильтрацией. Среду разливают по пробиркам и скашивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность скошенного агара и культивируют 1-4 сут. Положительный результат (защелачивание сре­ды) — красно-малиновое окрашивание среды.

Среда Симмонса.Используют для определения способности бактерий утилизировать цитрат как единственный источник углерода. Состав: агар — 20 г, NaCl — 5 г, MgS0₄ х 7Н₂0 — 0,2 г, К₂НР0₄ — 1 г, NH₄ х Н₂Р0₄ — 1 г, C₆H₅0_?Na₃ х 5Н₂0 — 3 г, бромтимоловый синий — 0,08 г, вода дистиллированная — 1000 см³.

     В дистиллированной воде растворяют агар. Соли растворяют отдельно в небольшом объеме воды и затем смешивают с агаром, до объема 1000 см³. Устанавливают рН 7,2, добавляют 40 см³ 0,2%-ного водного раствора бром-тимолового синего. Среду перемешивают, разливают в пробирки по 5 — 7 см³ и стерилизуют 15 мин при 121° С. После автоклавирования агар ска­шивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность агара и инкубируют. При положительном результате отмечают рост культуры на среде и измене­ние ее цвета с оливкового на синий.

Среда с алгинатом натрия. Используют для определения способности бак­терий утилизировать натрия алгинат как единственный источник углерода. Состав среды аналогичен составу среды Симмонса, но вместо натрия цитрата вносится 2,5 г натрия алгината. Положительным считают изменение цвета среды. Микроорганизмы, не обладающие способностью усваивать натрия алгинат, на данной среде не растут.

Среды Гисса. Используют для изучения способности ферментации угле­водов с образованием кислоты и газов. Состав: пептон — 10 г, натрия хлорид — 5 г, вода дистиллированная — 1000 см³,0,1%-ный индикатор Андреде, углевод 0,5% (адонит, глицерин, сор­бит, дульцит, целлобиоза, раффиноза, трегалоза, салицин, арабиноза, мальто­за, рамноза, ксилоза) или 1,0% (глюкоза, лактоза, маннит, сахароза).

В дистиллированной воде растворяют навески пептона, натрия хлорида, добавляют индикатор, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,1-7,2 и стерилизуют 15 мин при 111 ° С. Затем добавляют углевод. Приготовленную среду разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 110° С.

 

  Среда для выявления фенилаланиндезаминазы . Состав: сухой дрожжевой экстракт—3 г, натрий хлористый — 5 г, L-фенилалапин — 1 г, Na₂HP0₄ — 1 г, агар — 12 г, вода дистиллированная — 1000 см³. Смешивают воду и дрожжевой экстракт, нагревают, добавляют компо­ненты и кипятят до расплавления агара, рН среды 7,0-7,2. Горячую среду фильтруют, разливают в пробирки по 2-3 см³ и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среду скашивают.

Испытуемую культуру засевают штрихом по поверхности агара и через сутки инкубации добавляют на поверхность культуры несколько капель 10%-ного водного раствора железа хлорида (FeCl₃). При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет, при отрицательном результате сохраняется желтое окрашивание.

 

Среда для выявления β-галактозидазы . В 100 см³ расплавленного и охлажденного до 40-45° С МПА асепти­чески добавляют 20 см³ 1%-ного водного раствора О-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. Среду разливают по пробиркам.

Испытуемую культуру засевают уколом петлей до дна пробирки. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С.

При положительной реакции среда окрашивается в желтый цвет одним из конечных продуктов гидролиза О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида О-нитрофенолом.

 

Среды для выявления лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы и чргининдегидролазы . Состав: мясная вода — 400 см³, пептон — 5 г, глюкоза — 1 г, вода дистиллированная — 600 см³, 0,1%-ный спиртовой раствор крезолового красного — 5 см³, 1,6%-ный спиртовой раствор бромкрезолового пурпурного — 0,6см³, L-лизин (или орнитин, или аргинин) —10 г.

Мясную воду, пептон, глюкозу и дистиллированную воду смешивают, устанавливают рН 6,0-6,1. Вносят аминокислоту, кипятят 8-10 мин, до­бавляют индикатор и разливают в агглютинационные пробирки по 3 см³. Стерилизуют 30 мин при 110° С. Цвет среды розовый.

Испытуемую культуру засевают в среды с аминокислотами (опыт) и среду безаминокислоты (контроль). Во все пробирки вносят стерильное вазелиновое иасло до получения слоя в 4-5 мм. Пробирки инкубируют 4 дня при 37° С.

При положительной реакции (защелачивание среды) наблюдается синee окрашивание в опытных пробирках и желтое — в контрольной.

 

Среда для определения пиразинамидазной активности у Y . enterocolitica . Состав: трипсинизированный соевый агар — 30 г, дрожжевой экстракт сухой — 3 г, пиразинкарбоксиамид — 1 г, трис-малат буфер 0,2 М, рН 6,0 — 1000 см³.

Составные части среды смешивают и подогревают на водяной бане до их растворения. Разливают по 5 см³ в пробирки, стерилизуют 30 мин при 112° С и скашивают.

 

Среда для определения калъцийзависимости роста у Y . е nterocolitica . В качестве питательной основы используют коммерческую среду для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (агар АГВ).

К стерильному расплавленному и охлажденному до 50° С агару добав­ляют (из расчета на 100 см³) 8 см³ 0,25 М стерильного натрия щавелевокис­лого, среду тщательно перемешивают и вносят 4 см³ 0,5 М стерильного раствора магния хлорида. Готовую среду разливают по чашкам Петри.

 

Определение индолообразования . Испытуемую культуру выращивают в пробирке с бульоном Хоттингера. В пробирку с культурой вносят 2-3 капли эфира, тщательно ее встря­хивают, оставляют в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфи­ра. Осторожно добавляют 0,5 см³ реактива Эрлиха, выдерживают 5 мин и учитывают результат. При наличии индолообразования слой эфира приоб­ретает розово-красный цвет.

Для приготовления реактива Эрлиха в 95 см³ 96%-ного этанола раство­ряют 1 г парадиметиламинобензальдегида и добавляют 20 см³ концентри­рованной хлористоводородной кислоты (НС1).

 

---

Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 267; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!