Лабораторная диагностика клебсиелл

⇐ ПредыдущаяСтр 10 из 12Следующая ⇒

Род Klebsiella в настоящее время объединяет 4 вида бактерий: K . pneumoniae , K . oxytoca , K . terrigena , K . planticola . Вид K . pneumoniae подразделяется на 3 подвида: pneumoniae , ozaenae , rhinoscleromatis.

Клебсиеллы широко распространены в природе и выделяются из множества объектов внешней среды включая почву, воду (как пресную, так и морскую), злаки, овощи, молочные продукты и т.д. (преимущественно K . terrigena , K . planticola). K . oxytoca в большинстве случаев выделяется из желудочно-кишечного тракта млекопитающих. У человека способны вызывать оппортунистические инфекции, внутрибольничные инфекции у новорожденных, урологических больных. Патогенными для животных и человека являются и бактерии рода K . pneumoniae. У человека они вызывают заболевания дыхательных путей: пневмонии, риносклерозы и озены, выделяются при заболеваниях урогенитального тракта, мозговых оболочек, глаз, суставов, позвоночника, при гнойно-септических процессах и острых желудочно-кишечных заболеваниях.

Для ветеринарной практики интерес представляет K . pneumoniae подвида pneumoniae, т.к. не только является представителем резидентной микрофлоры кишечника, но может играть роль этиологического фактора при пневмониях, метритах, маститах, септических процессах у крупного рогатого скота, свиней, лошадей, обезьян и других видов животных, принимать участие в развитии желудочно-кишечной патологии у молодняка животных.

Лабораторная диагностика основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным свойствам.

Бактериологическое исследование

Материал для исследования. Свежие трупы павших или убитых с диагностической целью больных животных целиком, голова, трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, почка, селезенка, сердце, перевязанное лигатурой вблизи аорты, брыжеечные лимфоузлы, отрезок пораженного участка тонкого отдела кишечника, перевязанного с двух сторон.

Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии животных с клиническими признаками диареи.

Микроскопическое исследование исходного материала. Из поступившего материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Клебсиеллы представляют собой грамотрицательные овальной формы палочковидные клетки размером 0,3-1,5x0,6- 6,0 мкм. Спор не образуют, но имеют капсулу.

Выделение и идентификация культур клебсиелл

Культивирование. Клебсиеллы являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофы, обладающие и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура роста 36-37° С, рН 7,2. Хорошо растут на всех широко используемых в лабораторной практике питательных средах.

Исследуемый материал (за исключением содержимого толстого отдела кишечника и фекалий) высевают в пробирки с МПБ, на МПА, дифференциально-диагностические среды Эндо и Плоскирева.

Соскоб с пораженного участка слизистой оболочки тонкого отдела кишечника (примерно 0,5 г) суспендируют в 10 см³ стерильного физиологического раствора, выдерживают для осаждения крупных частиц 10-15 мин при комнатной температуре и надосадочную жидкость высевают на среды Эндо и Плоскирева. Аналогичным образом производится посев фекалий.

Посевы инкубируют при 37° С в течение 18-24 часов. По истечении указанного срока пробирки и чашки Петри с посевами просматривают, отбирают характерные для клебсиелл колонии, готовят из них мазки, которые окрашивают по Граму и по Гинсу (для выявления капсул).

При отсутствии роста на плотных питательных средах, но наличии его в МПБ и при обнаружении в нем небольших грамотрицательных палочек осуществляют пересев культур из МПБ на плотные питательные среды. Пересевы инкубируют при указанных выше условиях.

Характерные для клебсиелл колонии, состоящие из грамотрицательных, образующих капсулу палочек, отбирают для дальнейших исследований.

Характер роста клебсиелл на питательных средах. В жидких питательных средах клебсиеллы растут в виде равномерного помутнения с образованием осадка, пленки на поверхности среды, а иногда и пристеночного кольца. Наряду со штаммами, хорошо ферментирующими лактозу, имеются и штаммы со слабой лактазной активностью. Поэтому, в зависимости от степени ферментации лактозы, на дифференциально-диагностических средах колонии могут быть как красные, розовые, непрозрачные с металлическим блеском (т.е. напоминающие лактозопозитивные эшерихии), так и прозрачные, бледно-розовые или бесцветные. На среде Плоскирева колонии могут иметь бежевый или желтый оттенок. Во всех случаях колонии имеют гладкую выпуклую поверхность, ровные края, чаще всего слизистую консистенцию.

На МПА клебсиеллы образуют характерные крупные, выпуклые, слизистые, часто сливающиеся колонии. Чаще всего они непрозрачны в проходящем свете, а в косопроходящем свете имеют яркую розово-дымчатую окраску. В мазках, приготовленных из таких колоний и окрашенных по-Гинсу, отчетливо выявляется капсула.

Поскольку характер роста на дифференциально-диагностических средах малоинформативен для суждения о принадлежности выделяемых культур к клебсиеллам, выделение возбудителя из исследуемого материала для учшей дифференциации от эшерихии рекомендуют проводить на 48-часовой агаровой культуре.

Морфология клебсиелл в культуре. В мазках, приготовленных с питательных сред, клебсиеллы обнаруживают в виде неподвижных, овальной формы палочек размером 0,3-1,5x0,6-6,0 мкм. Грамотрицательные. Спор лишены, образуют капсулу. В мазках располагаются поодиночке, парами или цепочками.

Идентификация клебсиелл по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для клебсиелл культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами идентифицируют с целью установления родовой, видовой и подвидовой принадлежности на основании изучения ферментативных свойств.

Клебсиеллы оксидазоотрицательные. Индол не выделяют (за исключением K . oxytoca ). По пробе с метиловым красным, реакции Фогеса-Проскауэра, способности расти на среде Симмонса с цитратом виды варьируют. Как правило, по лизиндекарбоксилазе положительные, по орнитиндекарбоксилазе и агрининдигидролазе отрицательные. Некоторые виды уреазоположительные. Сероводород не образуют. Способны расти в присутствии KCN. Желатину не разжижают. Большинство видов сбраживает все обычно тестируемые углеводы, за исключением дульцитола и эритритола с образованием кислоты и газа. Встречаются штаммы, не образующие газ.

Дифференцирующие признаки видов рода Klebsiella представлены в таблице 18, ферментативные свойства, отличающие подвиды вида K . pneumoniae — в таблице 19.

Определенные трудности возникают в отличии штаммов K . pneumoniae от неподвижных штаммов Enterobacter aerogenes, которые очень медленно разжижают желатину. Решающее значение при этом имеют тесты на уреазу (K . pneumoniae подвида pneumoniae уреазоположительные) и орнитиндекарбоксилазу (K . pneumoniae подвида pneumoniae имеют отрицательный признак).

Таблица 18 - Дифференцирующие признаки видов

рода Klebsiella

Тест или субстрат	K.pneumoniae	K.oxytoca	K.terrigena	K.planticola
Индол	-	+	-	X
Газ из лактозы: при 44,5° С при 37° С	+ -	- +	- -	- -
Рост при 10° С	-	+	+	+
Ферментация: инулина D-мелезитозы L-сорбозы	- - X	+ X +	X + +	X - +
Утилизация: Гентизата m-гидроксибензоата гидрокси-L-пролина	- - X	+ + X	+ + X	- - +

Обозначения:«+» — 90% и более штаммов позитивны по данному признаку; «—» — 90% и более штаммов негативны по данному признаку; «х» — 11 - 89% штаммов имеют положительный признак.

У клебсиелл известно более 80 капсульных (К) антигенов, связанных с их капсульной полисахаридной субстанцией.

Лучшее образование последней отмечается при использовании сред, обогащенных углеводами или азотом. Капсулы разных К-антигенов имеют принципиально сходное строение. Основу их полисахаридов составляют галактоза, глюкоза, манноза, фруктоза, рамноза. Сахара связаны между собой глюкуроновыми или реже галактоуроновыми кислотами. Это сходство, по мнению многих исследователей, является основной причиной наличия выраженных перекрестных реакций, затрудняющих серотипирование клебсиелл по К-антигену.

О-антигены клебсиелл (известно более 10; однозначного мнения по отдельным из них у различных авторов нет) также являются полисахаридами.

В отличие от К-антигенов в их составе нет гексуроновых кислот, но имеются типичные для О-антигенов глюкозамин, гептоза и другие компоненты. Серотипирование клебсиелл по О-антигену затруднено т.к. требует бескапсульных форм бактерий. Термообработка для этих целей непригодна, т.к. капсула термостабильна. Получение бескапсульных форм путем длительного пассирования культур на 50%-ном желчном бульоне, рекомендованное F.Kauffmann (1966), также вызывает значительные трудности и малопригодно для повседневной лабораторной практики

Таблица19 - Дифференцирующие признаки

подвидов K . pneumoniae

Тест или субстрат	Pneumoniae	Ozaenae	Rhinoscieromatis
Газ из глюкозы	+	X	+
Кислота из: лактозы дульцита	+ X	ср	-
Реакция с метиловым красным	-	+	+
Реакция Фогес-Проскауэра	+	-	-
Цитрат Симмонса	+	X	-
Малонат натрия	+	-	+
Урсаза	+	X	-
Утилизация органических кислот (Кауфман-Петерсон): Цитрата Тартрата М уката	X X +	X X X	- - -
Лизиндекарбоксилаза	+	X	-
Аргининдегидролаза	-	X	-

Обозначения: то же, что в табл. 109; «ср» — слабая реакция.

В силу вышеперечисленного методы серотипизации клебсиелл для лабораторной диагностики к настоящему времени отсутствуют.

Определение патогенности. Патогенность клебсиелл обусловлена такими факторами вирулентности, как фимбрии, которые подобно фимбриальным антигенам других энтеробактерий способствуют их адгезии на эпителиальных клетках слизистых оболочек. В пользу того, что одним из факторов вирулентности является капсула, свидетельствует тот факт, что она обнаруживается у большинства свежевыделенных от людей и животных штаммов (бескапсульные штаммы часто выделяются из мочи), а бескапсульные варианты клебсиелл могут восстанавливать капсулу не только при пассировании на углеводсодержащих средах, но и через организм животных. Установлено, что K . pneumoniae продуцирует термостабильпый и термолабильный токсины. Последний снижает интенсивность торможения агрегации тромбоцитов.

Для определения патогенных свойств K . pneumoniae готовят суточные агаровые культуры из штаммов, выделенных из двух внутренних органов и тканей погибших или фекалий больных животных. Каждую из двух культур смывают стерильным физиологическим раствором, готовят суспензии концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1см³ по оптическому стандарту мутности, после чего смешивают их в равной пропорции.

Приготовленной суспензией заражают внутрибрюшинно трех белых мышей живой массой 14-15 г в дозе 0,5 млрд. микробных клеток (0,5 см³). Патогенность считают установленной, а изучаемые штаммы K . pneumoniae относят к возбудителю болезни, в случае гибели двух и более мышей в течение трех суток после заражения.

При выделении культур K . pneumoniae из селезенки, крови сердца, костного мозга, головного мозга (не менее чем из двух перечисленных органов и тканей) патогенные свойства этих культур в биопробе на белых мышах не определяют и относят такие культуры к возбудителю болезни.

Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 269; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 3 4 5 6 7 8 91011 12 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!