Животных и из продуктов животного происхождения
Виды животных | Сероварианты сальмонелл |
Крупный рогатый скот | S. dublin, S. typhimurium, S. abortus bovis, S. enteritidis S. enteritidis |
Свиньи | S. choleraesuis, S. typhisuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S. brandenburg, S. oranienburg, S. muenster |
Мелкий рогатый скот | S. abortus ovis, S. typhimurium, S. paratyphi A, S. dublin |
Лошади | S. abortus equi, S. typhimurium, S. dublin |
Птицы | S. gallinarum, S. pullorum, S. typhimurium |
Дикие теплокровные животные, в т.ч.: грызуны; рептилии | S. typhimurium, S. enteritidis S. arizonae |
Продукты животного происхождения | S. typhimurium, S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum, S. choleraesuis, S. derby, S. infantis, S. agona, S. panama, S. enteritidis, S. heidelberg |
Мазки фиксируют метиловым спиртом (5 мин) или этиловым спиртом (15 мин) ивысушивают.
Сухие препараты помещают строго горизонтально на мостики во влажной камере (чашка Петри) для предупреждения высыхания сыворотки.
Сухие сыворотки в ампулах разводят стерильным физиологическим раствором рН — 7,4 до указанного на этикетке первоначального объема, а затем дополнительно до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы.
На каждый мазок наносят 2 капли подготовленной таким образом сыворотки и распределяют ее по всей поверхности мазка. Окрашивание препарата осуществляют 15-20 минут при комнатной температуре или в термостате при 37° С. Для лучшего окрашивания препараты каждые 5-7 минут слегка покачивают.
Препараты промывают физиологическим раствором рН — 7,4 в течение 5 минут, заменяя раствор за это время 4-5 раз. Отмытые препараты дополнительно отмывают дистиллированной водой и подсушивают.
|
|
После этого на мазок наносят небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и одной части 0,2 М фосфатного буфера рН — 8,0 и накрывают покровным стеклом. Для иммерсии используют не флуоресцирующее масло или его заменитель, приготовленный из чистого диметилфталата (100 мл) и нафталина сублимированного (1,75 г) или тимола чистого (5 г). Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом при увеличении 5x90 и силе тока 4,1 А.
Окрашенные флуоресцирующей сывороткой сальмонеллы имеют светящийся периферический контур (ободок). Это характерное свечение контура визуально оценивается в крестах: (++++) — сияющее зеленовато-желтое свечение; (+++) — яркое желтовато-зеленоватое свечение; (++) — умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свечение отчетливо заметного контура; (+) — слабое беловатое свечение различимого контура; (-) — клетки в виде сероватых теней, контур отсутствует или слабо заметен на отдельных участках периферии клеток.
Положительным результатом считается свечение типичных для сальмонелл форм, оцениваемое не ниже чем в два креста, при условии, что в контрольных препаратах, окрашенных рабочим разведением гетерологичной сыворотки, оно оценивается отрицательно. Собственное бесконтурное свечение некоторых бактерий всегда оценивается отрицательно, хотя оно иногда хорошо выражено.
|
|
Для проведения исследования патологического материала и мяса готовят несколько комплектов отпечатков на стекле. После фиксирования один комплект отпечатков окрашивают комплексной флуоресцирующей сальмонеллезной сывороткой и проводят флуоресцентную микроскопию.
Если сальмонеллы будут обнаружены хотя бы в одном из препаратов, устанавливают их принадлежность к той или иной группе. С этой целью окрашивают другие комплекты препаратов, используя раздельно, и прежде всего те О-сыворотки, которые соответствуют сальмонеллам, наиболее часто выявляемым у животных данного вида
Выявление сальмонелл серогрупп В, C 1, С2, Д, Е экспрессным методом в реакции коагглютинации . С этой целью используют набор сальмонеллезных диагностикумов серогрупп В, С1, С2, Д, Е для реакции коагглютинации.
Для постановки реакции исследуемый материал подращивают в жидкой питательной среде (селенитовый бульон, МПБ) в течение 12-18 часов при 37° С. После подращивания культуральную среду (2-3 см3) прогревают в водяной бане при 100° С в течение 30 мин, при необходимости центрифугируют или фильтруют, чтобы получить прозрачный раствор. Приготовленный таким образом материал можно хранить при 4-6° С не более 7-10 суток, в замороженном состоянии — неограниченное время.
|
|
Сухие диагностикумы разводят дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке.
На предметное стекло, размеченное на сектора, наносят 6 отдельных капель исследуемой пробы, затем в первые 5 капель добавляют по 1 капле соответствующего диагностикума, а в последнюю — 1 каплю несенсибилизированного стафилококка (1%-ная взвесь стафилококка Cowan 1 для отрицательного контроля, который ставится с каждой пробой исследуемого материала). Кроме того, контролем служат: капля каждого диагностикума, смешанная с каплей фосфатно-солевого буфера или физиологического раствора (контроль диагностикумов на гомогенность) — на отдельном стекле (ставится один раз в день постановки реакции); капля диагностикума с каплей гомологичного антигена, прилагаемого к набору (положительный контроль) — на отдельном стекле (ставится по мере необходимости).
Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская их слияния, стекло помещают во влажную камеру на 30 мин при комнатной температуре.
|
|
Результат реакции коагглютинации учитывают через 30 мин при просмотре стекол над вогнутым зеркалом, регистрируя появление агтлютинации стафилококков.
Положительной реакцией считается появление хлопьев агглютинированных стафилококков в одной из капель с каким-либо диагностикумом при сохранении гомогенности контрольных капель и наличии положительных реакций диагностикумов с гомологичными антигенами.
Интенсивность агглютинации оценивают в крестах:
«++++» — все стафилококки склеены и легко скатываются к краю капли при наклоне стекла, жидкость просветлена;
«+++» — склеена большая часть стафилококков, частичное просветление жидкости;
«++» — на фоне слабого просветления жидкости четко виден агглютинат;
«+» —мелкие легкие хлопья, жидкость остается непросветленной;
«-» — признаков агглютинации нет, взвесь стафилококков гомогенна, сходна с отрицательным контролем.
более 7—о хранить при 4—Положительной считают реакцию с оценкой не ниже двух крестов. Положительная реакция коагглютинации свидетельствует о наличии в исследуемом материале сальмонелл соответствующей серогруппы. При необходимости определения серовара сальмонелл проводят бактериологические исследования с выделением чистой культуры и ее изучением, как было указано выше. При отрицательной реакции коагглютинации дальнейшее проведение бактериологического анализа на наличие сальмонелл серогрупп В, С1, С2, Д, Е считается нецелесообразным.
Идентификация сальмонелл с помощью сальмонеллезного бактерио фага. Идентификация сальмонелл может быть осуществлена с помощью сальмонеллезного
О-бактериофага, который высоко специфичен для этих бактерий. Он лизирует 97,5% штаммов сальмонелл и только 0,3% штаммов культур, принадлежащих к другим родам семейства кишечных (Килеско А.В., 1963; Покровский В.И., 1985 и др.). С этой целью две капли 4-или 18-часовой бульонной культуры испытуемого штамма (можно использовать взвесь суточной агаровой культуры на физиологическом растворе) наносят тонко оттянутой пастеровской пипеткой на хорошо подсушенный МПА (рН 7,2-7,4) в чашке Петри. После подсыхания на одну из капель петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра наносят О-бактериофаг, а на другую в качестве контроля — каплю бульона.
Фаг наносят неразведенный или в разведении 1:5 (в зависимости от указания на этикетке). На одной чашке, таким образом, можно испытать одновременно 8-10 культур. Чашку с нанесенными культурами и О-бактериофагом помещают на 18-20 часов в термостат при 37° С, после чего учитывается результат. Положительный результат реакции при появлении на месте нанесения фага четко очерченной зоны сливного лизиса оценивают на ++++, при наличии отдельных негативных колоний, отчетливо видимых глазом, в зависимости от их количества реакцию оценивают на +++, ++ или +.
При отрицательном результате (отсутствие лизиса) в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле.
Культура, лизировавшаяся фагом, является подозрительной на сальмонеллезную и может быть прямо с чашки испытана в РА на стекле с поливалентной сальмонеллезной сывороткой. В случае положительного результата РА культуру засевают на скошенный агар и на пестрый ряд для изучения биохимических свойств и антигенной структуры (с помощью сальмонеллезных монорецепторных сывороток), без чего не представляется возможным дать окончательный ответ о принадлежности культуры к определенному сероварианту сальмонелл. Культуры, не чувствительные к О-бактериофагу, подлежат также дальнейшему изучению (биохимическому и серологи ческому). Большую помощь О-бактериофаг может оказать при изучении атипичных, трудно диагностируемых культур. Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к О-бактериофагу. Резистентными к нему могут быть некоторые штаммы S . derby , S . tennessee , S . anatum , S . london и некоторые другие, в то время как культуры, лишь сходные с сальмонеллезными по биохимическим свойствам (например, лактозонегативные E . coli ), как правило, не лизируются этим фагом.
Серологическая диагностика сальмонеллеза. Серологическая диагностика сальмонеллеза в пробирочной реакции агглютинации
Вспомогательным тестом, результаты которого учитывают в комплексе с другими диагностическими исследованиями на сальмонеллез, может служить пробирочная РА, которую ставят с сыворотками, полученными от животных, подозрительных в заболевании сальмонеллезом.
Для постановки пробирочной РА отдельными наборами выпускаются серогрупповые антигены и сыворотки трех серологических групп — В, С1 и Dl для диагностики сальмонеллеза.
Сыворотки крови животных исследуют с различными антигенами в зависимости от вида животного, а именно: овец — с антигеном серогруппы В и, как исключение (при соответствующих бактериологических показаниях), с антигеном D крупного рогатого скота — с антигеном серогрупп Df и В; свиней — с антигеном всех трех серогрупп — В, С1 и D1
Реакцию агглютинации проводят в объеме 1см3 в двух разведениях сыворотки — 1:100 и 1:200. При исследовании с одним антигеном для каждой испытуемой сыворотки требуется три пробирки: в первую наливают 0,96 см3, во вторую и третью — по 0,5 см3 фенолизированного физиологического раствора. Затем в первую пробирку вносят 0,04 см3 испытуемой сыворотки, смешивают и переносят 0,5 см3 во вторую, из второй такое же количество в третью, из третьей 0,5 см3 удаляют.
После приготовления разведенной сыворотки во вторую и третью пробирки вносят по 0,5 см3 антигена в рабочем разведении, указанном на этикетке, в первую — 0,5с м3 физиологического раствора. Разведение сыворотки в первой пробирке является контрольным.
Одновременно ставят контроль антигена с гомологичной серогрупповой (контрольной) сывороткой. Для этого сухую контрольную сыворотку разводят физиологическим раствором до объема, указанного на флаконе, и готовят двукратные разведения, начиная с 1:25 до предельного титра сыворотки. Во все пробирки, кроме первой, вносят по 0,5 см3 антигена в рабочем разведении, в первую пробирку — 0,5 см3 физиологического раствора.
Для контроля антигенов на самоагглютинацию к 0,5 см3 антигена в рабочем разведении добавляют 0,5 см3 физиологического раствора. Штативы с пробирками тщательно встряхивают до получения равномерной взвеси, помещают в термостат при 37-38° С на 4-10 часов, затем дополнительно выдерживают при комнатной температуре 14-20 часов, после чего производят учет реакции.
Реакцию считают: положительной — при оценке результатов на три-четыре креста в разведении сыворотки 1:200; сомнительной — при оценке три-четыре креста в разведении 1:100 или один-два креста в разведении 1:200; отрицательной — при оценке один-два креста в разведении 1:100 или полном отсутствии агглютинации.
Во всех случаях в контролях должны быть следующие показатели: положительная реакция с позитивной агглютинирующей сывороткой до ее предельного титра; отрицательные результаты в контрольных пробирках с сывороткой без антигена и в контроле антигена с физиологическим раствором.
От сомнительно реагирующих животных сыворотку крови исследуют повторно через 10-15 дней. Если нет повышения титра сальмонеллезных агглютининов, животных считают отрицательно реагирующими.
Кровекапельная реакция агглютинации (ККРА) и кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации (ККРНГА). Данные методы исследований используют для прижизненной диагностики пуллороза-тифа птиц и выявления сальмонеллоносительства у птиц.
Для постановки ККРА используют цветной пуллорный антиген. От точности выполнения реакции во многом зависит результат исследований. На обезжиренное предметное стекло рекомендуется наносить 1 каплю антигена и примешивать к нему кровь, которую берут от исследуемой птицы из гребешка или подкрыльцовой вены. Для оптимального соотношения антигена и крови (примерно 5:1 соответственно) последнюю лучше примешивать платиновой net лей из проволоки толщиной 0,5-0,6 мм и внутренним диаметром кольца 2,5-3 мм.
Предметное стекло плавно покачивают и учитывают результат в течение 1-2 мин. В положительных реакциях образуются хорошо выраженные синеватые хлопья агглютината, а жидкость просветляется. Если образуется небольшое количество мелких хлопьев, то реакцию считают сомнительной. При отрицательной реакции агглютинат не образуется и жидкость не просветляется.
Для постановки ККРНГА используют эритропитарный диагностикум. При этом к одной капле диагностикума добавляют одну каплю крови (т.е. соотношение компонентов реакции должно быть близко к 1:1). Результаты реакции учитывают через 2 мин после тщательного смешивш шя эритроцитарного антигена и крови при плавном покачивании предметного стекла. Образование хорошо заметных коричневатых хлопьев свидетельствует о положительной реакции, слабовыраженных мелкозернистых хлопьев — о сомнительном результате. Отрицательная реакция характеризуется стабильной гомогенной взвесью эритроцитов в капле исследуемой крови.
Обе реакции дают лучшие результаты, если температура воздуха в помещении, где исследуют птицу, не ниже 16-18° С, а предметные стекла с компонентами реакции размещают на грелке-качалке М.А.Артемичева с температурой 37-42° С. При более низкой температуре и при невысоком уровне антител в крови реакцию на стекле в течение 2 мин визуально можно не заметить.
При необходимости реакции можно ставить пробирочным методом. Диагностическим титром в развернутой РНГА при исследовании сыворотки крови кур служит разведение 1:40 и выше.
Возраст цыплят, в котором удается выявить наибольшее количество носителей возбудителя пуллороза-тифа, 50-55 дней, индюшат — 45-50 дней. Взрослых кур исследуют в возрасте 7 мес, а индеек — в 11 мес.
Лабораторная диагностика иерсиниозов
Род Yersinia согласно «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology» (1994) объединяет 11 видов: Y . pestis ; Y . pseudotuberculosis ; Y . enterocolitica ; Y . kristensenii ; Y . intermedia ; Y . frederiksenii ; Y . aldovae ; Y . rohdei ; Y . mollaretii ; Y . bercovieri ; Y . ruckeri. Из них зоопатогенными видами являются: Y . pestis — возбудитель чумы, острого инфекционного заболевания животных и человека, относящегося к группе особо опасных инфекций; Y . pseudotu berculosis — возбудитель псевдотуберкулеза животных; Y . enterocolitica — возбудитель иерсиниоза животных и человека; Y . ruckeri— возбудитель «красного рта» радужной форели и других видов рыб, остановимся на диагностике иерсиниоза и псевдотуберкулеза.
Иерсиниоз - инфекционная болезнь многих видов животных и человека, характеризующаяся у молодняка животных гастроэнтероколитами с развитием диареи (фекалии нередко с примесью крови), которая может перемежаться с запорами. Реже могут наблюдаться артриты, конъюнктивиты, дерматиты и бронхопневмония. У коров могут наблюдаться маститы, эндометриты, рождение нежизнеспособного приплода, энтериты. У кроликов болезнь протекает в виде эпизоотии с высокой летальностью. При этом у больных животных отмечают анорексию, прогрессирующее истощение, субфебрильную температуру и последующий смертельный исход. Широко распространено длительное бактерионосительство. У человека кроме диареи возможно развитие псевдоаппендицита, мезентериалыюго лимфаденита, артритов, менингита, гепатита, поражения сетчатки, сепсиса, сопровождающегося высоким уровнем смертности.
Возбудителем болезни является Y . enterocolitica. Эти бактерии выделены практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков, насекомых. Они обнаружены в воде, почве, сточных водах, пищевых продуктах, включая овощи и фрукты. Широкой распространенности иерсиний способствуют их психрофильные свойства (способность размножаться и накапливаться в различных питательных субстратах при 4° С).
Псевдотуберкулез — инфекционная болезнь многих видов животных и человека, характеризующаяся преимущественно латентным течением, мезентериальным лимфаденитом, длительным расстройством деятельности желудочно-кишечного тракта. Возможно развитие тяжелой септицемии. У лошадей может наблюдаться пневмония и сильное обезвоживание на фоне диареи. У крупного рогатого скота наблюдают пневмонию, аборты и маститы. Аборты и маститы при псевдотуберкулезе могут быть у овец и коз. У кроликов болезнь возможна в острой, подострой и хронической формах. У птиц отмечают острую форму заболевания с развитием поносов, одышки, истощением, взъерошенностью шерсти, потемнением кожных покровов. У собак и кошек псевдотуберкулез чаще всего начинается остро без заметного продромального периода. Появляются лихорадка, угнетение, анорексия, диарея, рвота, боль в мышцах при пальпации. В ряде случаев отмечают кашель, а также признаки поражения печени (желтушное окрашивание склер, темный цвет мочи). Нередко клинические признаки кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза оказываются весьма сходными.
У людей различают кишечную, скарлатиноподобную, артритную формы течения псевдотуберкулеза. Нередко болезнь протекает с поражением печени и напоминает болезнь Боткина. Возможно развитие септической формы, особенно у детей, пожилых и ослабленных лиц.
Возбудителем болезни является Y . pseudotuberculosis, выделяемая от млекопитающих, птиц, пресмыкающихся, земноводных, членистоногих и рыб.
Принципиальные схемы лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сходны и потому ниже излагаются совместно.
Лабораторная диагностика иерсиниозов основана на результатах бактериологического и серологического исследований.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 316; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!