Темы для реферативных сообщений
Т. В. Жаворонок
О. А. Тимин
Практикум
по биологической химии
и биохимии полости рта
Томск
Сибирский государственный медицинский университет
2016
УДК: 577.1:612.31015(075)](075.8)
ББК: 28.707.2я73
Авт. зн.: Ж-135
Авторы:
Т. В. Жаворонок, О. А. Тимин
Ж-135 Т. В. Жаворонок, О. А. Тимин. Практикум по биологической химии и биохимии полости рта. – Томск: СибГМУ, 2016. – 280 с.
Практикум подготовлен в рамках дисциплины «Биологическая химия и биохимия полости рта» в соответствии с Федеральным государственным стандартом высшего профессионального образования и предназначено для студентов, обучающихся по основной профессионально-образовательной программе — программе специалитета «Стоматология».
Практикум нацелен на освоение наиболее важных разделов биологической химии с акцентированием внимания на основах биохимии полости рта и отдельных аспектах клинической биохимии, необходимых для понимания будущими врачами-стоматологами метаболизма человека в норме и при патологических сдвигах, приводящих к развитию заболеваний полости рта и организма в целом. Практикум включает как традиционные, так и современные методы лабораторных исследований важнейших химических компонентов организма и контрольные материалы.
УДК: 577.1:612.31015(075)](075.8)
ББК: 28.707.2я73
Рецензент:
Д. И. Кузьменко – доктор медицинских наук, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики Сибирского государственного медицинского университета
|
|
|
Практикум утвержден и рекомендован к печати Центральным методическим советом ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (протокол № ХХ от 06.04.2016 г.)
Ó Т. В. Жаворонок, О. А.Тимин, 2016
Ó ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, 2016
Введение
Разработка данного издания преследует цель адаптации учебного процесса к новым требованиям доказательной медицины, которые базируются на развитии научных представлений о метаболизме организма человека, усовершенствовании методологии диагностики заболеваний, широком внедрении в клиническую лабораторную практику современных методов. Актуальность практикума при обучении будущих врачей-стоматологов определена необходимостью закрепления теоретического курса биохимии, изучения эффективных подходов к оценке обмена веществ в полости рта и организме в целом, получения целостного представления о востребованных на современном этапе методах лабораторной диагностики и приобретения основ практических навыков по предмету.
Материал структурирован по отдельным темам согласно последовательности изучения разделов дисциплины. Вначале представлены базовые темы о строении и функциях белков (исходя из постулата «жизнь – это водная форма существования белковых тел»), основах обмена веществ и энергии, далее реализован переход к вопросам регуляции и частной биохимии органов и тканей, биохимии полости рта. Это позволяет расширить знания фундаментальных основ биохимии, уяснить особенности метаболизма в норме и при патологических процессах, приводящих к развитию заболеваний полости рта.
|
|
|
В предлагаемом практикуме обоснованы актуальность и цели каждой темы (одно или несколько занятий), приведены вопросы для самостоятельной подготовки, руководство по лабораторным работам с указанием практического или клинико-диагностического значения изучаемых показателей. В ряде случаев поставлены вопросы, ответ на которые позволяет студенту правильно оформить протокол исследования и понять диагностическое значение работы.
Преподавание биологической химии, особенно с аспектами клинической биохимии, требует от студента умения не только грамотно провести анализ, но и осознать клиническую значимость результатов. Поэтому в настоящее издание включены работы, проводимые в русле поискового исследования, когда студент выбирает нужный вариант анализа в зависимости от итогов предшествующего этапа. В практикуме присутствует блок практических работ, которые позволяют углубить теоретические знания по биохимии полости рта и оценить нарушения метаболизма, приводящие к развитию патологии стоматологического профиля. В рамках этого блока сделан акцент на актуальную методологию и предоставлена возможность ознакомиться с современным комплексным подходом к ИФА-диагностике, ПЦР-анализу.
|
|
|
В практикуме присутствуют задания по составлению ряда схем и таблиц, нацеленные на углубление знаний по ключевым вопросам биохимии (обмен аминокислот, углеводов, липидов, энергетический обмен, эндокринная регуляция) и предполагающие работу над ними по мере изучения материала. Предложены тесты и ситуационные задачи для самоконтроля полученных знаний, вопросы к итоговым занятиям и семинарам по наиболее сложным темам, перечень экзаменационных вопросов. Все это поможет студентам всесторонне осмыслить изучаемый материал и получить глубокие знания по предмету.
Список сокращений
АДФ – аденозиндифосфат
АлАТ – аланинаминотрансфераза
АМФ – аденозинмонофосфат
|
|
|
АсАТ – аспартатаминотрансфераза
АТФ – аденозинтрифосфат
ГАМК – гаммааминомасляная кислота
ГАП – гидроксиапатит
ГМФ – гуанозинмонофосфат
ГТТ – глюкозотолерантный тест
ГТФ – гуанозинтрифосфат
ДАГ – диацилглицерол
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНП – дезоксирибонуклеопротеины
ДНФГ – динитрофенилгидразин
ДХГБС – дихлоргидроксибензолсульфонат натрия
ДХФИФ – дихлорфенолиндофенол
ЖКТ – желудочно-кишечный тракт
ИМФ – инозинмонофосфат
ИФ3 – инозитолтрифосфат
ИФА – иммуноферментный анализ
КоА – коэнзим А
КОС – кислотно-основное состояние
ЛПНП – липопротеины низкой плотности
ЛПВП – липопротеины высокой плотности
ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности
ЛХАТ – лецитинхолестеролацилтрансфераза
МАГ – моноацилглицерол
НАД+ – никотинамидадениндинуклеотид
НАДН – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАДФ+ – никотинамидадениндинуклеотид фосфат
НАДФН – никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный
ПАЛФ – пиридоксальфосфат
ПДААБ – пара-диметиламиноазобензол
ПОЛ – перекисное окисление липидов
ПОМК – проопиомеланокортин
ПТГ – паратгормон
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РНК – рибонуклеиновая кислота
РНП – рибонуклеопротеины
РЭС – ретикуло-эндотелиальная система
СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита
ТАГ – триацилглицеролы
ТГФК – тетрагидрофолиевая кислота
ТМФ – тимидинмонофосфат
ТТГ – тест на толерантность к глюкозе
ТХУ – трихлоруксусная кислота
УДФГК – уридиндифосфоглюкуроновая кислота
УИРС – учебно-исследовательская работа студентов
УМФ – уридинмонофосфат
УТФ – уридинтрифосфат
ФАД – флавинадениндинуклеотид
ФАДН2 – флавинадениндинуклеотид восстановленный
ФАФС – фосфоаденозинфосфосерная кислота
ФИФ2 – фосфатидилинозит фосфорилированный
ФМН – флавинмононуклеотид
ХЛ – хемилюминесценция
цАМФ – циклический аденозинмонофосфат
цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат
ЦМФ – цитозинмонофосфат
ЦНС – центральная нервная система
ЦТАБ – цетилтриметиламмониумбромид
ЦТК – цикл трикарбоновых кислот, цикл Кребса
ЦТФ – цитозинтрифосфат
ЩФ – щелочная фосфатаза
ЭДТА – этилендиаминтетраацетат
ВАР – костный изофермент щелочной фосфатазы
EIA – иммуноферментный анализ, ИФА (Enzyme Immuno Assay)
ELISA – ферментосвязанный иммуносорбционный анализ, вариант ИФА (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay)
FAT – тест на флуоресцирующие антитела (Fluorescent Antibody Test)
GLUT – глюкозный транспортер (белок-переносчик)
IFA – иммунофлуоресцентный анализ (ImmunoFluorescence Assay)
N‑MID – средний полипептидный фрагмент остеокальцина
NF-kappaB ядерный фактор каппа B
OPG – остеопротегерин
PCR – полимеразная цепная реакция (Polymerase Chain Reaction)
PCR-аssay ПЦР‑исследования
RANK – рецептор активатора ядерного фактора каппа B
(Receptor activator of NF-kappa B)
RANKL – лиганд рецептора активатора ядерного фактора каппа B
(Receptor Аctivator of NF-kappa B Ligand)
TRACP 5B тартрат‑резистентная кислая фосфатаза
Раздел 1.
Строение, свойства, функции белков
и нуклеиновых кислот
ТЕМА 1.1.
Строение, классификация и роль аминокислот.
Структура молекул белка
Актуальность
Белки ‑ важнейший пластический материал клеток живого организма, по структуре являются сложными полимерными соединениями, состоящими из аминокислот в качестве мономерных единиц. Именно особенностями аминокислот, составляющих полимер, обусловлено огромное разнообразие состава и структуры белков организма и их высокая индивидуальная специфичность. Знание структурной организации и свойств белковых молекул необходимо для понимания основных специфических функций (каталитической, регуляторной, рецепторной, транспортной и других), благодаря которым белкам принадлежит решающая роль во всех процессах жизнедеятельности. Вне состава белков аминокислоты участвуют в образовании биогенных аминов, азотистых оснований и мононуклеотидов, нейромедиаторов, липидов и других веществ. Ряд из них используется в качестве лекарств.
Цель
1) Знакомство со строением аминокислот, входящих в состав белков организма человека, классификациями аминокислот по биологической роли и строению бокового радикала. Изучение роли функциональных групп аминокислот.
2) Приобретение практических навыков по проведению качественного анализа биологических жидкостей и растворов на присутствие аминокислот и белков, основанных на знании принципов цветных реакций (биуретовой, ксантопротеиновой, нингидриновой, реакции Фоля).
3) Знакомство с уровнями организации молекул белка. Изучение роли аминокислот в построении функционально активных молекул белков.
4) Создание представления о значении определения аминокислот для анализа состава белков и диагностики нарушений азотистого обмена.
Вопросы для самоподготовки
1) Классификации аминокислот. Понятия «протеиногенные аминокислоты» и «непротеиногенные аминокислоты».
2) Свободные аминокислоты в организме, их разнообразие и роль.
3) Основные физико-химические свойства аминокислот. Роль функциональных групп аминокислот, значение и разнообразие свойств бокового радикала.
4) Незаменимые аминокислоты. Формулы и значение.
5) Гидрофобность и гидрофильность аминокислот, изоэлектрическая точка, дополнительный отрицательный и положительный заряды при рН 7,0.
6) Пептидная связь. Строение, образование, свойства пептидной связи.
7) Построение, название пептидов, растворимость, ионизация и заряд при рН 7,0, движение в электрическом поле. Изоэлектрическая точка и факторы, влияющие на неё.
8) Понятие белка, элементарный состав, роль в организме. Организация белковой молекулы, характеристика и биологический смысл появления уровней организации.
9) Обнаружение аминокислот и белка, удаление белка из биожидкостей.
Самостоятельная работа
Заполнить графы 1,2,3,4 таблицы протеиногенных аминокислот (приложение 1). Структурные формулы аминокислот писать в виде NH2–CH–COOH
│
R
Лабораторная работа 1.
Цветные реакции на белки и аминокислоты
Цветные реакции являются качественными универсальными (биуретовая, нингидриновая и др.) или специфическими (реакция Фоля, Миллона и др.) методами определения и позволяют обнаружить белок и аминокислоты.
Реактивы
1) 0,5 % раствор нингидрина, 2) 10 % и 30 % растворы NaOH, 3) 1 % раствор CuSО4, 4) 5 % раствор Pb(CH3COO)2, 5) 5 % раствор нитропруссида Na, 6) реактив Миллона, 7) конц. H2SO4, 8) конц. HNO3.
Материал для исследования
1) 1 % водный раствор яичного белка (имеет полный набор аминокислот).
Ход работы
В пронумерованные пробирки наливают по 5 капель исследуемой жидкости. Руководствуясь приведёнными ниже указаниями, проделывают цветные реакции, наблюдают результаты и записывают выводы в таблицу.
Биуретовая реакция
Универсальная реакция на обнаружение пептидной связи в белках и пептидах. Биуретовую реакцию дают вещества, содержащие не менее 2 пептидных груп.
Принцип реакции
Пептидная группа образует в щелочной среде с ионами Сu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей и состава аминокислот. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству пептидных групп.
Проведение анализа
В пробирку с исследуемой жидкостью вносят 3 капли 10 % NаОН и 1 каплю 1 % CuSО4.
Нингидриновая реакция
Это универсальная реакция для обнаружения a‑аминогрупп, содержащихся в аминокислотах, пептидах, белках.
Принцип метода
a‑аминогруппа аминокислот, взаимодействуя с нингидрином, образует комплексное соединение синего или сине-фиолетового цвета: при нагревании аминокислот с нингидрином происходит окислительное дезаминирование a‑аминогрупп и восстановление нингидрина. Восстановленный нингидрин реагирует с аммиаком и другой молекулой окисленного нингидрина с образованием окрашенного продукта. Иминокислоты (пролин и оксипролин) дают продукт желтого цвета.
Проведение анализа
Исследуемую жидкость смешивают с 5 каплями раствора нингидрина. Пробирки нагревают и кипятят 1 мин. Отмечают появление сине-фиолетового окрашивания.
Ксантопротеиновая реакция
Выявляет наличие ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан).
Принцип метода
Ароматическое кольцо при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образует динитросоединение желтого цвета.
Проведение анализа
К исследуемому раствору добавляют 2 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают. Наблюдают за появлением желтого окрашивания, переходящего при добавлении 30 % NаОН в оранжевое.
Реакция Фоля
Выявляет аминокислоты со слабо связанной серой (цистеин, цистин).
Принцип метода
Сульфгидрильные группы в белках подвергаются щелочному гидролизу, в результате сера отщепляется в виде сульфида натрия, далее Na2S может вступать в реакцию с Pb(CH3COO)2 и дает черный или бурый осадок сульфида свинца.
Проведение анализа
Исследуемый раствор и 5 капель 30 % NaOH кипятят 1‑2 минуты. К 5 каплям гидролизата добавляют 1 каплю раствора уксуснокислого свинца и нагревают до кипения. Отмечают появление бурого или черного осадка.
Практическое значение
Реакции на аминокислоты и белок могут быть полезны при изучении состава веществ, установлении белковой природы веществ и оценке количества белка. Цветные реакции используют в биохимических исследованиях и в клинико-биохимических лабораториях для обнаружения белка и аминокислот и оценки содержания белка в биологических жидкостях, в фармацевтической практике для качественного анализа белковых лекарственных средств.
В медицине, фармации, косметологии, биологии широкое применение нашли аминокислотные гидролизаты, получаемые при промышленном гидролизе белков и содержащие полный набор заменимых и незаменимых аминокислот.
Оформление работы
Результаты оформляют в виде таблицы. Интенсивность окраски помечают следующим образом: – отсутствие; + слабая; ++ сильная; +++ очень сильная. В выводе указывают, какие вещества обнаружены в составе яичного альбумина.
|
| Реакции | Что содержится | ||||
| Исследуемый материал | Биуретовая | Нингидриновая | Ксантопротеиновая | Фоля | ||
| яичный белок | ||||||
Лабораторная работа 2.
Исследование наличия белка и свободных аминокислот
в биологическом материале
Химический состав биологических жидкостей (кровь, моча, желудочный сок, слюна и т.п.) характеризуется постоянством и отражает состояние биохимических процессов, происходящих в органах и тканях. Отклонение от нормы в качественном и количественном составах биологических жидкостей может быть показателями патологического процесса.
Материал для исследования
Сыворотка крови, моча, слюна (для сбора слюны прополаскивают ротовую полость 1‑2 минуты с 50 мл дист. воды для удаления остатков пищи, собирают слюну в стаканчик/пробирку, избегая пенообразования).
Реактивы
1) 0,5 % раствор нингидрина, 2) 10 % раствор NaOH, 3) 5 % раствор CuSO4, 4) 10 % раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ).
Проведение анализа
В 3 пробирки добавляют по 5 капель сыворотки, слюны и мочи, проводят биуретовую реакцию (см. "Лаб. работа 1"), определяя наличие или отсутствие белка в пробах.
Дальнейшие действия зависят от наличия или отсутствия белка в пробах:
1) если жидкость не содержит белок, то ее в количестве 10 капель помещают в другую пробирку, где проводят нингидриновую реакцию для определения наличия или отсутствия a‑аминокислот (см. "Лабораторная работа 1");
2) если в биологической жидкости присутствует белок, то для последующего исследования берут 20 капель жидкости, добавляют 5 капель 10 % раствора ТХУ и нагревают до осаждения белка. Белок отделяют центрифугированием (в этом случае реакцию проводят в центрифужной пробирке и после центрифугирования отбирают надосадок пипеткой в чистую пробирку) или фильтрованием через бумажный фильтр (предварительно смочив фильтр водой). В безбелковом надосадке/фильтрате определяют наличие/отсутствие a‑аминокислот с помощью нингидриновой реакции: добавляют 5 капель 0,5 % нингидрина и нагревают в кипящей водяной бане или над пламенем спиртовки.
Практическое значение
Состав биологических жидкостей в ходе формирования патологии изменяется, что выявляют при диагностике заболеваний и контроле лечения. Многие методы оценки метаболитов углеводного, липидного и других обменов требуют отсутствия белков в биожидкости, поэтому анализ начинают с удаления белка путем осаждения с последующей фильтрацией или центрифугированием.
Цветные реакции на белок и аминокислоты используют в биохимических исследованиях для контроля полноты удаления белка из жидкости, наличия белка и аминокислот в биологических средах, а также качественного анализа белковых лекарственных средств в фармацевтической практике.
Оформление работы
Результаты анализа сыворотки крови, слюны, мочи на наличие белка и аминокислот заносят в таблицу, отмечая знаками "+" и "–".
Делают вывод о содержании белка и аминокислот в указанных биологических жидкостях, поясняя причины и значение различий.
| Объект исследования | Обнаруженные соединения | |
| Белок | Свободные аминокислоты | |
| Сыворотка крови | ||
| Слюна | ||
| Моча | ||
Вопросы для самоконтроля
1). Понятия «аминокислота», «пептид», «белок».
2). Элементарный состав и функции белков в организме.
3). Строение всех протеиногенных аминокислот, основные физико-химические свойства аминокислот. Роль функциональных групп.
4). Классификации аминокислот по биологической роли, строению радикала, физико-химическим свойствам, растворимости в воде. Незаменимые аминокислоты. Непротеиногенные аминокислоты.
5). Реакция образования пептидной связи, лежащей в основе построения первичной структуры белковой молекулы. Свойства пептидной связи. Построение пептида, название, заряд, движение в электрическом поле при разных значениях рН среды.
6). Уровни организации молекул белка, стабилизирующие связи. Биологический смысл появления различных уровней в структуре белка.
7). Особенности аминокислотного состава и структурной организации молекул коллагена.
ТЕМА 1.2.
Состав и свойства белков.
Методы очистки и исследования белков
Актуальность
Пути выделения белков из раствора при различных способах осаждения, в том числе высаливании и денатурации, широко используются в медицине для диагностических целей, получения и очистки белковых лекарственных препаратов, в экспериментальных исследованиях.
Цель
1) Изучить физико-химические свойства белков (молекулярная масса, размеры, форма, ионизация, гидратация, растворимость) и основные типы структур белковых молекул.
2) Научиться осаждать белки из раствора разными методами и применять способность к осаждению белков в клинике (осадочные реакции).
3) Изучить способы разделения и очистки белков, усвоить использование методов разделения белков в клинике.
Вопросы для самоподготовки
1) Молекулярная масса белковых молекул. Способы ее определения (ультрацентрифугирование, гель-фильтрация).
2) Типы структур белковых молекул (первичная, вторичная, надвторичная, третичная, четвертичная). Стабилизирующие связи. Особенности структуры и связей молекулы коллагена I типа – основного белка тканей зуба.
3) Глобулярные и фибриллярные белки. Сходство и различия в свойствах.
4) Ионизация молекул белка (заряд), амфотерность, гидратация, растворимость. Свойства растворов белков. Принцип ионообменной хроматографии.
5) Изоэлектрическая точка. Свойства аминокислот и белковых молекул в изоэлектрической точке (изоэлектрическое состояние).
6) Свойства растворов белков. Факторы, стабилизирующие молекулы белков в растворе. Коллоидные свойства белков.
7) Факторы денатурации белков: физические, химические и биологические.
8) Механизмы денатурации и изменения структуры при денатурации белков. Свойства денатурированного белка.
9) Способы удаления белка из раствора: осаждение кислотами, тяжелыми металлами, органическими растворителями. Принцип реакций осаждения.
10) Способы очистки белковых растворов от примесей (высаливание, гель-фильтрация, диализ). Принципы методов.
11) Ренативация, фолдинг, рефолдинг. Шапероны (белки теплового шока и др.).
Темы для реферативных сообщений
1) Биохимические основы доврачебной и I врачебной помощи при отравлении органическими и неорганическими кислотами, солями тяжелых металлов.
2) Принципы методов, области применения и эффективность диализа и плазмафереза в клинической практике.
3) Биохимические основы осадочных проб (тимоловой и Вельтмана), применение в диагностике заболеваний.
Лабораторная работа 1.
Высаливание белков
Высаливанием называют процесс осаждения белка солями щелочных, щелочно-земельных металлов и нейтральными солями. Процесс высаливания обратим, так как сохраняет нативные свойства белков.
Реактивы
1) насыщенный раствор (NH4)2SO4, 2) кристаллический (NH4)2SO4, 3) 10 % раствор NaOH, 4) 1 % раствор CuSO4.
Материалы для исследования
Сыворотка крови, раствор яичного белка.
Принцип
Под действием нейтральных солей, солей щелочных и щелочно-земельных металлов происходит нейтрализация заряда и дегидратация белковых частиц. Используя разные концентрации солей, можно разделить белки на фракции. При растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных биологических и физико-химических свойств.
Проведение анализа
Параллельно с высаливанием раствора яичного белка проводят аналогичное осаждение и разделение белков сыворотки крови.
К 20 каплям яичного белка (или сыворотки крови) добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и получают полунасыщенный раствор, в котором выпадает осадок яичного глобулина (или глобулинов крови). Через 5 мин осадок отделяют фильтрованием с помощью стеклянной воронки с бумажным фильтром. Наличие белка на фильтре доказывают биуретовой реакцией ‑ используют 10 % NaOH для защелачивания среды и 1 % СuSO4 для цветной реакции
Часть прозрачного фильтрата отбирают пипеткой в чистую пробирку для проведения биуретовой реакции ‑ доказывают наличие альбуминов с помощью добавления растворов NaOH и СuSO4.
К остальному фильтрату добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения раствора, при этом выпадает выраженный осадок альбуминов. Для проверки обратимости осаждения к осадку альбуминов добавляют 1‑2 мл дистиллированной воды, осадок полностью растворяется.
Оформление работы
Отмечают принцип метода, регистрируют результаты анализа и делают вывод о возможности очистки/разделения мелко‑ и грубодисперсных белков данным методом.
Практическое значение
Метод использовался в прошлом в клинических лабораториях для разделения альбуминов и глобулинов, определения их соотношения в сыворотке крови. В норме соотношение альбумин/глобулин в сыворотке крови человека колеблется в пределах 1,5‑2,3 и изменяется при патологии: например, при воспалительных заболеваниях увеличивается содержание глобулинов и снижается концентрация альбуминов.
Лабораторная работа 2.
Исследование денатурации белков
Денатурацией белков называют изменение структурной организации белковой молекулы (чаще третичной, четвертичной и даже вторичной структуры), приводящее к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Обратимой денатурация может быть только при сохранении первичной структуры белка и возврате молекулы в оптимальные для нее или близкие к таковым условия. Денатурирующие факторы делятся на химические (минеральные и органические кислоты, щелочи, тяжелые металлы и др.), физические (ультразвук, высокая температура, радиация и др.), биологические (протеолитические ферменты – трипсин и др.). Большинство химических агентов вызывает необратимую денатурацию белков, несмотря на различия в механизмах воздействия.
Реактивы
1) 20 % раствор сульфосалициловой кислоты, 2) 10 % раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 3) конц. HNO3, 4) конц. H2SO4, 5) 1% раствор СuSO4, 6) 5 % раствор Pb(CH3COO)2, 7) танин, 8) ацетон, 9) этанол, 10) 1 % и 10 % растворы СН3СООН, 11) насыщенный раствор NaCl, 12) 10 % раствор NaOH.
Материалы для исследования
Сыворотка крови, яичный белок (1 % водный р-р).
Исследование денатурации белков
при нагревании в различных условиях
Принцип
Тепловая денатурация влияет на заряд и гидратную оболочку белков, снижая их гидрофильность и устойчивость в растворе. Денатурированный белок подвержен воздействию электролитов (ионы Na+ и Cl‑) и изменениям рН среды.
Проведение анализа
В 5 нумерованных пробирок наливают по 10 капель раствора яичного белка.
· В 1-ю пробу добавляют 2 капли дистиллированной воды (контроль, нейтральная среда), нагревают на кипящей водяной бане. Наблюдают помутнение раствора вследствие термической денатурации белка.
· Во 2-ю пробу добавляют 2 капли 1 % раствора СН3СООН (слабокислая среда), нагревают на кипящей водяной бане. Наблюдают сначала помутнение (белок теряет заряд, приближаясь к изоэлектрическому состоянию), при дальнейшем нагревании – белый хлопьевидный осадок.
· В 3-ю пробу добавляют 2 капли 10 % раствора СН3СООН (сильнокислая среда), нагревают на кипящей водяной бане. Обычно осадок не образуется, так как частицы денатурированного белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд.
· В 4-ю пробу добавляют 2 капли 10 % раствора СН3СООН и 1 каплю насыщенного раствора NaCl (сильнокислая среда + электролит), нагревают на кипящей водяной бане. Осадка выпадает много, так как ионы Na+ и Cl– нейтрализуют заряд на частицах денатурированного белка.
· В 5-ю пробу добавляют 2 капли 10% раствора NaOH (щелочная среда), нагревают на кипящей водяной бане. Осадка нет, так как отрицательный заряд на частицах денатурированного белка усиливается.
Оформление работы
Результаты оформляют в виде таблицы, помечая интенсивность осадка: – отсутствие; + слабый; ++ сильный; +++ очень сильный. Для каждого случая делают вывод о механизмах осаждения белка.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 106; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!