Абсолютное количественное определение с использованием стандартной кривой

⇐ ПредыдущаяСтр 9 из 16Следующая ⇒

В абсолютном выражении количество (например, номер копии или единица измерения массы)

неизвестный образец интерполируется из ряда стандартов известного количества.

Для построения стандартной кривой требуется шаблон с известной концентрацией.

Затем выполняется разведение этого шаблона, и эти разведения служат

стандарты. Неизвестные тестовые образцы анализируются с помощью стандартов в

тот же экспериментальный прогон. Стандартная кривая, построенная из разбавленного стандарта

шаблон может быть использован для определения целевого количества в неизвестном образце

путем интерполяции, аналогично использованию стандартов размера молекул для определения

молекулярный размер неизвестной полосы ДНК на агарозном геле.

Страница 40

Пример использования стандартной кривой для определения количества копий конкретного

целевая нуклеиновая кислота показана на рисунке 4.1. В этом примере нас интересовало

определение количества копий гена β-актина в двух образцах А и В.

10-кратный ряд разведений был создан из образца с известной концентрацией

β-актина, в результате чего был получен набор стандартов, содержащий 10 2 –10 7 копий шаблона.

Стандарты и образцы затем анализировали в одном и том же цикле.

Была построена стандартная кривая с логарифмом начального числа копий

стандарты, нанесенные вдоль оси x, и их соответствующие значения C T, нанесенные вдоль

ось у (рисунок 4.1). Уравнение для линии линейной регрессии [y = mx + b, или

C T = m (количество бревен) + b] показано в верхней части графика.

Основываясь на уравнении для линейной регрессии, мы можем вывести следующее

Уравнение для определения количества неизвестного образца:

анализ данных КПЦР в реальном времени

абсолютное количественное определение

Рис. 4.1. Пример абсолютного количественного определения с использованием стандартной кривой. Определить номер копии

β-актина в неизвестных образцах A и B, 10-кратные разведения известной концентрации матрицы (10 2 –10 7

копии β-актина) анализировали с двумя неизвестными образцами в одном опыте с использованием анализа SYBR Green I

специфичные для β-актина. Линия регрессии от кривой разбавления была использована для определения количества копий

неизвестные образцы. Все стандартные разведения и неизвестные образцы были проанализированы в трех экземплярах на

Система обнаружения в реальном времени Chromo4.

= 10

где n = C T

н - б

(

)

C T - B

(

)

Количество бревен

у = -3,50х + 37,20; r 2 = 0,999

Образец Б

Образец А

Количество = 10

Страница 41

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

Номера копий отдельных повторных анализов для образцов А и В были

определяется с использованием их значений C T в приведенном выше уравнении. Как правило, когда копия

отбираются пробы, сообщается среднее и стандартное отклонение отдельных проб,

как показано в последнем столбце таблицы 4.1. Важно отметить, что стандарт

Кривая может использоваться только для интерполяции, а не экстраполяции, количества неизвестного

образец. Это потому, что анализ не может быть линейным вне диапазона, охватываемого

стандарты проверены.

Распространенные приложения ПЦР в реальном времени, которые используют абсолютную количественную оценку, включают

определение числа копий хромосом или генов и определение вирусной нагрузки.

Этот метод количественного определения концептуально прост, и математика

анализ легко выполнить. Метод, однако, требует надежного источника

шаблон известной концентрации, и стандарты должны быть усилены параллельно с

образцы каждый раз, когда проводится эксперимент.

4.2 Относительная количественная оценка

Когда следует использовать относительную количественную оценку?

Теперь давайте рассмотрим пример, который требует относительной количественной оценки. Исследователь

хочет знать, отличается ли уровень экспрессии р53 от раковой и

нормальные клетки яичников, и если да, то насколько. Он хочет выяснить родственника

количество, иногда называемое «кратной разницей», мРНК р53 в эквиваленте

количество двух тканей. Исследователь может выбрать один из следующих

экспериментальные проекты в зависимости от типа нормализатора, который он хочет использовать:

(1) Исследователь извлекает РНК из 1000 раковых и 1000 нормальных яичников

клеток, и определяет количество мРНК р53 в образцах, запустив

анализ обратной транскрипции (RT) КПЦР, специфичный для мРНК р53. Исследователь тогда

узнает относительную кратность разницы мРНК р53, взяв соотношение числа

молекул мРНК р53 в образцах РНК из эквивалентного числа раковых

и нормальные клетки яичников.

Таблица 4.1. Определение абсолютного количества копий β-актина у неизвестного

образцы А и В с использованием метода абсолютного количественного определения. Уравнение

Линия линейной регрессии, показанная на рисунке 4.1, была использована для расчета копии

количество неизвестных образцов.

Образец

Повторные

C T

Копии

18,61

204577

18,41

234115

18,87

172300

Средний

203664 ± 30,917

17,06

569789

17,07

563823

17,00

591173

Средний

574 928 ± 14 381

Страница 42

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

(2) Если исследователь ранее определил, что уровень мРНК GAPDH

Экспрессия идентична в раковых и нормальных клетках, исследователь может извлечь

РНК из приблизительно эквивалентного количества раковых и нормальных яичников

клетки без определения точного количества клеток. Уровень мРНК р53 и

МРНК GAPDH в образцах затем определяли анализом RT-КПЦР.

Относительную экспрессию р53 в раковых и нормальных клетках определяли, принимая

соотношение нормализованной по GAPDH экспрессии p53 в двух разных типах клеток.

В приведенном выше примере относительное количественное определение было выбрано потому, что исследователь

интересовало относительное количество целевой нуклеиновой кислоты в эквивалентных количествах

образцов А и В. Разница между двумя описанными методами анализа

выше тип нормализатора используется. В первом сценарии нормализатор является

количество клеток. Во втором сценарии нормализатором является мРНК GAPDH

уровень экспрессии, который ранее был определен как постоянный между

два типа клеток. Математические манипуляции для двух сценариев

представлены в разделах 4.2.2 и 4.2.3 соответственно. В обоих случаях конечный результат

является количественным описанием некоторого свойства одного образца относительно того же

свойство другого образца. Другими словами, используйте относительную количественную оценку для сравнения

конкретное свойство между несколькими образцами.

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 124; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 4 5 6 7 8910 11 12 13 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!